Визуализация нейронов тела гриба в мозге дрозофилы с помощью иммуноокрашивания

Поместите мозг дикого типа и мутантной дрозофилы в раствор, содержащий фиксатор и моющее средство. Инкубация с легким покачиванием.

Фиксатор сохраняет морфологию тканей, в то время как детергент проникает в клеточные мембраны.

Дайте мозгу осесть, затем удалите раствор.

Промойте салфетки с помощью буфера.

Добавьте блокирующий раствор для предотвращения связывания неспецифических антител.

Удалите раствор и добавьте первичные антитела, нацеленные на определенный белок, который регулирует развитие аксонов в нейронах грибовидного тела мозга, или MB.

Инкубируйте для стимулирования связывания антител.

Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела.

Инкубируйте с фторконъюгированными вторичными антителами, нацеленными на первичные антитела.

Промойте еще раз, чтобы удалить несвязанные антитела, затем снова суспендируйте мозг в монтажной среде.

Закрепите мозги на предметном стекле и визуализируйте их под флуоресцентным микроскопом.

По сравнению с диким типом, мозг мутантов демонстрирует дефектный фенотип, с аксональными неправильными проекциями и отсутствующими долями MB.

Под микроскопом с помощью пипетки P200 перенесите от 10 до 15 препарированных мозгов одного и того же генотипа в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитра, заполненную 4% параформальдегида, разведенным в PTN. Затем инкубируйте мозги в течение 20 минут с медленным покачиванием при комнатной температуре. После фиксации дайте мозгу осесть на дно трубки, затем снимите фиксатор.

Далее выполните две быстрые промывки с 500 микролитрами PTN на одну стирку. Обменивайте ПТН, как только мозги осядут в трубе. Далее выполните три длительные промывки PTN с помощью бережного перемешивания при комнатной температуре.

После этих промывок мозг может храниться в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия в PTN. После снятия последней промывки ПТН инкубируйте мозги в 0,5 миллилитрах блокирующего раствора не менее 30 минут при комнатной температуре, причем при слабом перемешивании. После удаления блокирующего раствора добавьте первичные антитела, разведенные в блокирующем растворе, и инкубируйте мозги при температуре 4 градуса Цельсия в течение двух суток при слабом перемешивании.

Удалите первичное антитело с помощью полосы промывки 5-wash PTN, а затем примените вторичные антитела. Дайте этим антителам инкубироваться с тканями в течение трех часов при комнатной температуре, будучи защищенными от света с помощью качания.

После инкубации мозга во вторичном растворе антител нанесите промывку PTN, покрывая образцы фольгой после каждой промывки, и в завершение удалите как можно больше буфера. Затем добавьте 75 микролитров флуоресцентной монтажной среды, препятствующей выцветанию, и проведите мозг и среду внутрь и наружу наконечника пипетки всего один раз. Затем трубку можно завернуть в фольгу и хранить при температуре 4 градуса Цельсия в течение нескольких дней, но в идеале приступать непосредственно к монтажу.

Чтобы смонтировать мозги, соорудите горку-мост. Расположите два нижних покровных стекла на расстоянии примерно 1 сантиметра друг от друга на положительно заряженном предметном стекле. Убедитесь, что положительно заряженное горло лежит лицевой стороной вверх. Затем приклейте покровные стекла к предметному стеклу лаком для ногтей и дайте лаку полностью высохнуть, прежде чем продолжить.

Далее поместите предметное стекло под стереомикроскоп и проведите пипеткой мозги и среду в пространство между покровными стеклами. Обязательно отрегулируйте освещение для улучшения визуализации мозга.

Затем аспирируйте лишнюю монтажную среду из предметного стекла, стараясь не задеть мозги. Затем отвлеките остатки излишков монтажного материала. Это позволит более точно расположить мозги.

Теперь с помощью щипцов сориентируйте мозг в виде сетки так, чтобы их доли антенн были обращены вверх. Затем наденьте покровный лист на мозги и с помощью лака для ногтей запечатайте края верхнего покровного стекла, которые прикреплены к базовым покровным стеклам. Теперь нагрузите центральную полость свежим монтажным материалом по каплям, позволяя фильтрующему материалу втягиваться под покровное стекло за счет капиллярного действия. Когда полость будет заполнена, полностью запечатайте ее прозрачным лаком для ногтей.