Индуцирование нейровоспаления у личинок данио-рерио с помощью инъекции липополисахарида

Возьмите личинок рыбок данио, находящихся под наркозом, в чашке, выстланной агарозным гелем, и убедитесь, что мозг обращен вверх для инъекций.

Поместите чашку под микроскоп, чтобы визуализировать желудочки мозга, которые представляют собой заполненные жидкостью полости в развивающемся мозге.

Возьмите иглу для микроинъекций, содержащую раствор липополисахаридов или ЛПС, бактериального компонента, чтобы вызвать иммунный ответ.

Расположите иглу над тектумом мозга, областью, содержащей нейроны и резидентные иммунные клетки, в частности микроглию.

Проколите головной мозг иглой и введите раствор ЛПС в желудочек.

Микроглия в окружающих тканях связывается с ЛПС через толл-подобные рецепторы.

Связывание вызывает высвобождение провоспалительных цитокинов, которые привлекают нейтрофилы к участку, что приводит к нейровоспалению.

Нейтрофилы генерируют всплески активных форм кислорода и высвобождают протеолитические ферменты, что приводит к гибели нейронов.

Перенесите личинки, вызванные нейровоспалением, в культуральную среду, чтобы сохранить их для последующих анализов.

Настройте микроманипулятор так, чтобы кончик иглы аппарата для микроинъекций находился в том же поле зрения, что и личинки при большом увеличении. Растопите раствор 2% агарозы в дважды дистиллированной воде с помощью микроволновой печи. Вылейте расплавленную агарозу в пластиковую посуду. С помощью пластиковой переносной пипетки транспортируйте обезболенных личинок к центру пластиковой посуды, покрытой 2% агарозой.

Ориентируйте установленных личинок мозговой стороной вверх для доступа иглы. Отрегулируйте увеличение микроскопа так, чтобы структура желудочков мозга рыбок данио четко отображалась в поле зрения. Осторожно поместите иглу над тектумом мозга. Очистите область мозга 70% этанолом и медленно проколите кожу мозга рыбки данио с помощью кончика иглы с помощью микроманипулятора.

Нажмите на ножную педаль, чтобы выбросить один нанолитр 1X PBS или липополисахарида в разных концентрациях. Переведите личинок в чистую среду Е3 сразу после инъекции.