Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 3:51 мин. • July 8th, 2025
Возьмите микроглиальные культуры в многолуночный планшет, содержащий среды.
Замените половину среды в испытательной лунке на среды, содержащие наночастицы серебра, а в контрольной лунке — на автомобильные среды. Инкубировать.
Микроглия интернализует наночастицы, активируется и высвобождает провоспалительные цитокины.
Перенесите автомобильную среду и кондиционированную среду, содержащую эти цитокины, в фильтры, установленные на сборных пробирках.
Центрифуга удаляет наночастицы, сохраняя цитокины.
Переверните фильтры в новые сборные трубки, центрифугируйте и соберите фильтрующий материал. Добавьте свежий материал.
Далее берут культуры нейронов гипоталамуса.
Замените половину фильтрующего материала в контрольной лунке на автомобильный фильтрующий материал, а в испытательном колодце — на кондиционированный. Инкубировать.
Цитокины связываются с рецепторами на нейронах гипоталамуса, активируя сигнальные пути, которые вызывают гибель нейронов.
Добавьте резазурин и инкубируйте.
В живых клетках ферменты дегидрогеназы восстанавливают слабофлуоресцентный резазурин до флуоресцентного резоруфина.
Измерьте флуоресценцию.
Сниженная флуоресценция указывает на повышенную гибель нейронов гипоталамуса, что предполагает нейротоксичность, вызванную наночастицами.
Для начала соберите по 200 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки пластины и загрузите ее в фильтр, который будет удалять наночастицы, помещенный в микроцентрифужную трубку.
Важно помнить, что при фильтрации наночастиц их размер, форма и концентрация влияют на эффективность фильтрации, поэтому рекомендуется заранее протестировать фильтрацию.
Теперь закрутите пробирки при 14 000 г при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем выбросьте проточный канал, который содержит наночастицы, и поместите фильтры вверх дном в новые пробирки для сбора. Переверните фильтры с температурой 1000 г в течение двух минут, чтобы собрать концентрированную кондиционированную среду, содержащую цитокины.
Далее увеличьте объем сбора до 400 микролитров свежеприготовленным дополненным ДМЕМ и храните тюбики на льду. Для этого анализа следует выделить клетки гипоталамуса из замороженных запасов, используя те же методы, которые описаны для создания культур микроглии. В конечном счете, используйте их для посева пластин с черными стенками и прозрачным дном по 5000 клеток на лунку в 200 микролитрах дополненного DMEM.
Через 24 часа культивирования удалите 100 микролитров среды и замените ее 100 микролитрами отфильтрованной и концентрированной среды, собранной из активированных культур микроглиальных клеток. Затем инкубируйте пластину в течение 24 часов в стандартных условиях. На следующий день добавьте в каждую лунку по 22 микролитра реактива резазурин, и продолжайте инкубацию в течение 20 минут. Затем с помощью многорежимного спектрофотометра проводят флуоресцентный измерители, чтобы оценить жизнеспособность клетки в терминах относительных единиц флуоресценции.