Иммуноокрашивание черепно-лицевых тканей мышей

Провести криорезы неподвижных эмбриональных черепно-лицевых тканей мыши, состоящих из клеток нервного гребня.

Промойте срезы в буфере, содержащем неионогенное моющее средство, чтобы удалить встраивающую среду и проникнуть в мембраны, обеспечивая доступ к внутриклеточным мишеням.

Добавьте блокирующий раствор для насыщения неспецифических сайтов связывания.

Удалите излишки блокирующего раствора. Затем инкубируйте с первичными антителами, нацеленными на ядерные антигены, такими как факторы транскрипции и маркеры пролиферации.

Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела.

Инкубируйте с флуорофор-конъюгированными вторичными антителами для связывания с первичными антителами, связанными с антигеном.

Удалите несвязанные антитела с помощью буфера.

Добавьте среду для защиты от выцветания с флуоресцентным ядерным красителем и накройте покровным стеклом.

Краситель окрашивает ядра, а среда, препятствующая выцветанию, защищает флуоресцентные сигналы во время визуализации.

Визуализируйте срезы под флуоресцентным микроскопом, чтобы оценить экспрессию и локализацию ядерных маркеров, указывающих на пролиферацию клеток нервного гребня и сигнальную активность.

Промойте предметные стекла в 0,1% PBST три раза по пять минут каждый, чтобы смыть ОКТ и пропитать срезы. Добавьте 200 микролитров раствора для блокировки на каждое предметное стекло и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем удалите блокирующий раствор, не промывая предметное стекло. Добавьте 100 микролитров первичного антитела, разведенного в блокирующем растворе, на каждое предметное стекло и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

Промойте предметные стекла PBS три раза по 10 минут каждый при комнатной температуре. Добавьте 100 микролитров вторичного антитела, разведенного в блокирующем растворе, и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре, защищенном от света. Промойте в PBS три раза по 10 минут каждый при комнатной температуре, но при этом защищенном от света месте. Чтобы установить слайды, добавьте две капли средства защиты от выцветания с DAPI на каждый слайд. Накройте крышкой и храните при температуре 4 градуса Цельсия до готовности к изображению.