Оценка структурной целостности нервно-мышечных соединений дорсальных продольных мышц у дрозофил

Начните с химически фиксированных грудных клеток дикого типа и трансгенных дрозофил в буфере.

У трансгенных грудных клеток нервно-мышечные соединения дорсальных продольных мышц содержат нейроны, которые экспрессируют мутантный белок, вызывающий нейродегенерацию.

Удалите буфер и заморозьте грудную клетку, чтобы предотвратить повреждение тканей во время бисекции.

Добавьте свежий буфер и переложите грудные клетки в посуду для вскрытия.

Расположите грудную клетку вентральной стороной вверх и удалите скопления нервных клеток, чтобы обнажить среднюю линию.

Рассекайте пополам по средней линии, чтобы получить гемиторасы.

Удалите лишнюю ткань.

Инкубируйте гемиторациозы в блокирующем буфере для проникновения в мембраны и предотвращения связывания неспецифических антител.

Добавьте фторофор-конъюгированные антитела, нацеленные на гликопротеин, экспрессируемый в нейронах NMJ и мышечных актиновых филаментах.

Удалите несвязанные антитела.

Расположите гемиторасы на горке моста, добавьте монтажный материал и закрепите ткани.

Визуализируйте под микроскопом.

По сравнению с диким типом, мутанты демонстрируют сниженное окрашивание нейронов, что указывает на нейродегенерацию, в то время как мышцы демонстрируют неповрежденную флуоресценцию.

Перед началом бисекции наденьте криозащитные перчатки и защитные очки и наполните колбу Дьюара жидким азотом. Используйте отбойник, чтобы захватить перьевое лезвие под углом и согнуть лезвие, чтобы отломить небольшой кусочек. Используйте прерыватель лезвия, чтобы зафиксировать лезвие в нужном положении, и используйте стеклянную дозатор Пастера для удаления всех PBS из пробирок с образцами.

С помощью криогенного пинцета погрузите пробирки в колбу с жидким азотом. Через 10 секунд с помощью пипетки Пастера добавьте примерно 300 микролитров ледяного PBS в каждую пробирку на льду и поместите одну брюшную сторону грудной клетки вверх в 10-сантиметровую чашку для препарирования, покрытую силиконовым эластомером, содержащую ледяной PBS. Используйте тупую пару щипцов, чтобы расположить грудную клетку, и пару тонких щипцов, чтобы удалить часть грудных ганглий, чтобы обнажить среднюю линию грудной клетки.

Используя среднюю линию грудной клетки в качестве ориентира, используйте лезвие, чтобы сделать неглубокий разрез через одну треть грудной клетки, и используйте тупые щипцы, чтобы расположить грудную клетку под углом 45 градусов. С помощью лезвия разрежьте прямо по средней линии грудной клетки, чтобы получить два гемоторака, и осторожно сделайте один или два надреза, чтобы удалить лишнюю ткань, не повреждая спинные продольные мышцы. Затем поместите образцы мышечной ткани в пробирку с соответствующей маркировкой PBS.

Когда все образцы грудной клетки будут разделены пополам, пеабилизируйте ткани в блокирующем буфере в течение как минимум одного часа при температуре 4 градуса Цельсия. По окончании инкубации вортекс сворачивают свежеприготовленный раствор структурного красителя и добавляют по 150 мкл красителя в каждый образец для двухчасовой инкубации на ротаторе при комнатной температуре в темноте. После окрашивания промойте образцы в PBST и поместите пять армирующих этикеток, уложенных и разрезанных пополам, на расстоянии 15 миллилитров, на одном предметном стекле микроскопа.

Используйте модифицированный наконечник для микропипетки, чтобы перенести грудные клетки на каждое предметное стекло, и используйте лабораторную салфетку, чтобы удалить излишки PBST. С помощью щипцов расположите образцы так, чтобы грудная клетка была обращена мышечной стороной вверх. Когда образцы будут правильно ориентированы, с помощью наконечника для дозатора объемом 200 микролитров нанесите 70 микролитров монтажной среды на каждое предметное стекло и накройте каждое предметное стекло покровным стеклом. Затем с помощью лака для ногтей обильно покройте внешние края покровных стекол, чтобы получить полное уплотнение вокруг каждой ткани.