Генерация дофаминергических нейрональных органоидов из эмбриональных стволовых клеток человека

Возьмем человеческие эмбриональные стволовые клетки, или чЭСК, в колбе, покрытой внеклеточным матриксом.

Замените среду средой для нервной индукции и инкубируйте, дифференцируя hESCs в колонии нейронных клеток-предшественников, или NPC.

Добавьте ферментативный раствор для диссоциации колоний.

Центрифугирование, удаление надосадочной жидкости и ресуспендирование клеток в индукционной среде с факторами роста для поддержки дифференцировки NPC.

Добавьте клеточную суспензию на микролунки обратной пирамидальной формы для формирования трехмерных нейросфер.

Перенесите нейросферы на пластину, покрытую внеклеточным матриксом, содержащую среду для дифференцировки с факторами роста и малыми молекулами. Инкубируйте при перемешивании, чтобы способствовать дифференцировке в дофаминергические прогениторные нейроны.

Замените среду средой для созревания нейронов и поместите нейросферы на мембранный диск во вставку из культуральной лунки, обеспечивая диффузию воздуха и питательных веществ.

Инкубируются в статических условиях с образованием трехмерных органоидов, состоящих из зрелых дофаминергических нейронов.

Эти органоиды, имитирующие развивающийся мозг, полезны для изучения дофаминергической дегенерации нейронов, характерной для болезни Паркинсона.

Замените среду стволовых клеток, используемую для поддержания плюрипотентности hESCs, на бессывороточную среду, содержащую двойной коктейль ингибирования SMAD для запуска нервной индукции и 10 микромолярный ингибитор ROCK для увеличения выживаемости клеток во время пассажа на следующий день. В первый день подготовьте микролуночный планшет с концентрацией 2,5 миллилитров на лунку бессывороточной среды, содержащей ту же концентрацию ингибитора ROCK и двойных молекул ингибирования SMAD.

Чтобы дифференцировать клетки по вентральному рисунку нервной трубки, добавьте SHH и FGF8 в концентрации 100 нанограмм на миллилитр и два микромолярных сглаженных агониста. После добавления среды центрифугируйте планшет при 1200 g в течение пяти минут, чтобы удалить пузырьки воздуха из микролунок. Как только микролуночный планшет будет готов к использованию с полудифференцирующей средой, удалите среду hESCs и быстро промойте PBS, не содержащим кальция и хлорида магния.

Диссоциируйте колонии в одноклеточную суспензию, добавив 7,5 мл рекомбинантного ферментативного раствора в колбу T75. Инкубируйте клетки в течение двух минут при температуре 37 градусов Цельсия, а затем добавьте 7,5 DMEM F-12. Впоследствии соберите клеточную суспензию и центрифугируйте при 300-кратном g в течение пяти минут. Затем удалите надосадочную жидкость и подсчитайте клетки в той же среде, которая использовалась для подготовки микролуночного планшета.

Отрегулируйте объем среды для получения клеточной суспензии, позволяющей формировать нейросферы, содержащие 1000 клеток на микролунку, путем подготовки 4,7 млн клеток в 2,5 миллилитрах среды, и добавления ее к предыдущим 2,5 миллилитрам уже помещенной в планшет среде. Для того чтобы правильно распределить ячейки в каждой микролунке, аккуратно встряхните пластину, и центрифугируйте ее при 300 раз g в течение пяти минут. Затем инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов, чтобы получить сферы.

На второй день аккуратно промойте микролунки средой и переложите сферы в обработанную тканью шестилуночную пластину. Поместите сферы во вращение при температуре 37 градусов Цельсия и меняйте половину среды на свежую среду каждые два-три дня. На 3-13 день, чтобы усилить нейронную индукцию и преобразовать ее в нейронных предшественников с идентичностью среднего мозга, дополните среду трехмикромолярным ингибитором GSK-3-бета. Разделите образец на два новых обработанных тканью шестилуночных планшета, чтобы уменьшить плотность сфер и избежать агрегации сфер.

На восьмой день начните созревание нейронов, переключившись на новую среду с факторами роста, и меняйте среду каждые два-три дня. На 21-й день поместите одну вставку с культуральными планшетами в одну лунку нового шестилуночного планшета и добавьте 1,2 миллилитра среды для созревания нейронов, используемой для дифференцировки нейросферы, под мембранную вставку. Затем поместите мембрану из ПТФЭ на вставку из культурального планшета.

Наконец, чтобы получить нейронный органоид, засейте около 100 нейросфер в условиях раздела воздух-жидкость на мембране из ПТФЭ. Остановите вращение на этом шаге и меняйте среду каждые два-три дня до тех пор, пока не будет достигнута требуемая временная точка дифференцирования.