Иммунофлуоресцентное окрашивание сиалогликопротеинов в нейральных прогениторных клетках и нейронах

Возьмем первичные нейральные стволовые и прогениторные клетки и нейроны, которые имеют сиалогликопротеины, помеченные репортером сиаловой кислоты.

Добавьте параформальдегид для фиксации клеток. Удалите излишки параформальдегида с помощью буфера.

Инкубируйте с реакционной смесью, содержащей химические зонды на основе биотина, восстановитель и катализатор на основе металлов.

Восстановитель активирует катализатор, способствуя биотинилированию сиалогликопротеинов.

Удалите реакционную смесь и промойте буфером. Добавьте фторофор-конъюгированный стрептавидин для связывания биотинилированных сиалогликопротеинов.

Удалите несвязанный стрептавидин и промойте буфером. Добавьте белки и неионогенное моющее средство, чтобы блокировать неспецифические участки и проникать в клетки.

Удалите этот раствор и инкубируйте с первичными антителами, нацеленными на определенные клеточные белки.

Удалите несвязанные антитела.

Инкубируйте с меченными флуорофорами вторичными антителами и флуоресцентным красителем для связывания первичных антител, связанных с белками, и мечения ядер.

Удалите несвязанные молекулы. Постирайте с буфером.

С помощью флуоресцентной микроскопии визуализируйте клетки, чтобы визуализировать флуоресцентные сиалогликопротеины и клеточные белки.

Сначала снимите вкладыши с планшетов для кокультуры и отсасывайте питательную среду со дна лунок. Затем промойте нервные клетки один раз подогретым PBS. Отсадите PBS из лунок и добавьте в каждую лунку по 1 миллилитру предварительно охлажденного 4% параформальдегида в PBS.

Зафиксируйте ячейки при комнатной температуре на 10 минут. Затем трижды промойте клетки предварительно охлажденным PBS. Отсадите PBS и добавьте в каждую лунку по 1 миллилитру свежеприготовленного биотин-конъюгированного буфера I. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого аспирируйте реакционный буфер из лунок, и трижды промойте клетки PBS. Добавьте по 1 миллилитру красящего буфера в каждую лунку клеток, и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут.

Далее аспирируйте буфер для окрашивания из лунок, и трижды промойте ячейки предварительно охлажденным PBS. Добавьте по 1 миллилитру блокирующего буфера в каждую лунку клеток, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Извлеките из лунок блокирующий буфер, и добавьте в каждую лунку по 1 миллилитру раствора первичного антитела. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

На следующий день удалите из лунок первичный раствор антитела. Трижды промойте клетки предварительно охлажденным PBS. Отсадите PBS из лунок, и добавьте по 1 миллилитру вторичного антитела в каждую лунку. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение двух часов. После этого отсасывайте раствор из лунок, и трижды промойте клетки предварительно охлажденным PBS.