Оценка in vitro агрегированного амилоида-β коллапса колбочек роста нейронов

Начните с предметного стекла с несколькими лунками, содержащего нейроны эмбриона мыши в среде.

Нейроны демонстрируют конусы роста на концах своих растущих аксонов. Эти структуры включают в себя тонкие выступы, называемые филоподиями, и листовидные расширения, называемые ламеллоподиями, которые состоят из актиновых филаментов и микротрубочек, компонентов цитоскелета.

Обработайте тестовые лунки агрегированным белком амилоид-β или Aβ, а контрольные лунки - раствором носителя.

В тестовых лунках агрегированный Aβ связывается с мембранными рецепторами, инициируя нисходящую сигнализацию, которая фосфорилирует белки, регулирующие цитоскелет

.

Фосфорилированные белки разрушают актиновые филаменты и микротрубочки, дестабилизируя структурную целостность конуса роста и вызывая его коллапс.

Инкубируйте с фиксатором, чтобы сохранить клеточную структуру, затем промойте клетки и установите их для визуализации.

С помощью микроскопа сравнить ячеистые структуры в тестовой и контрольной лунках.

Повышенная частота коллапса конуса роста в обработанных Aβ нейронах указывает на токсическое действие агрегатов Aβ.

Начните этот анализ, по крайней мере, за неделю до его проведения, открыв свежий флакон с коммерчески полученным полноразмерным A-бета-42 и растворив содержимое в стерильной дистиллированной воде до концентрации 0,5 миллимолара. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение семи дней, чтобы вызвать агрегацию и токсичность. Приготовьте аликвоты из агрегированного А-бета-42 и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования.

На четвертый день культивирования нейронов обработайте лунки 100 микролитрами 0,5 микромольного агрегированного A-бета-42 или раствором носителя в среде B в течение одного часа, как было показано ранее. По истечении часа удалите питательную среду и немедленно зафиксируйте нейроны 4% параформальдегидом, содержащим 4% сахарозы в PBS, в течение одного часа при 37 градусах Цельсия на горячей пластине.

Фиксация в основном важна, так как сохранение формы ростовых шишек имеет решающее значение для этого протокола.

После фиксации трижды промойте нейроны PBS. Затем, после снятия камеры, смонтируйте нейроны с помощью водной монтажной среды. Сушите монтажный материал при температуре 4 градуса Цельсия в течение двух-четырех дней. Захватите всю площадь каждой лунки с помощью 20-кратной линзы сухого объектива на инвертированном микроскопе.

Захват и анализ всей площади в каждой скважине важен для того, чтобы избежать субъективности.

Классифицируйте самые длинные нейриты каждого нейрона на стадии 3 или 4 как аксоны. Аксональные конусы роста, лишенные ламеллиподий или обладающие менее чем тремя филоподиями, считаются свернутыми конусами роста.