Визуализация бета-амилоидных пептидов в срезах коры головного мозга человека

Возьмите предметное стекло, содержащее кортикальный срез мозговой ткани, собранный у пациента с болезнью Альцгеймера. Ткань содержит нерастворимые отложения бета-амилоида в паренхиме и капиллярах головного мозга.

Погрузите предметное стекло в разбавленный спирт для удаления липидов и солей.

Умойтесь абсолютным спиртом, чтобы обезвожить ткань, затем нанесите фиксатор для сохранения архитектуры ткани.

Просушите предметное стекло пылесосом, удалив влагу.

Обработайте парами муравьиной кислоты во влажной среде, чтобы расщепить агрегаты бета-амилоида на более мелкие растворимые пептиды.

С помощью оптического сканера можно получить изображения структурных особенностей ткани для интерпретации данных масс-спектрометрии.

Распылите на образец матричный раствор.

С помощью масс-спектрометра применяют лазер, который поглощает матрица для ионизации пептидов. Затем детектор идентифицирует их на основе соотношения массы к заряду.

Анализируйте данные для получения изображений, выявляющих распределение бета-амилоидов в тканевой паренхиме и церебральных капиллярах.

Чтобы промыть срезы ткани, погрузите образцы в 40-100 миллилитров 70% этанола в стеклянную банку для окрашивания на 30 секунд, чтобы удалить эндогенные липиды и неорганические соли. Промойте образцы, используя последовательность промывки, указанную в текстовом протоколе. Затем высушите образцы в вакууме в течение 30 минут.

Теперь обработайте срезы тканей парами муравьиной кислоты для лучшей ионизации бета-амилоидных белков из тканей мозга, полученных при аутопсии. Для этого подготовьте духовку при температуре 60 градусов Цельсия и стеклянную посуду для инкубации с 5 миллилитрами 100% муравьиной кислоты. Поддерживайте влажность воздуха в стеклянной чашке для инкубатора на уровне насыщения.

Поместите предметные стекла в стеклянную чашку для инкубации, избегая погружения в муравьиную кислоту, и обрабатывайте в течение шести минут. Сделайте оптическое изображение образцов с помощью пленочного сканера, гелевого сканера или цифрового микроскопа. Выполняйте этот шаг при комнатной температуре.

Юстировка оптического изображения образцов необходима, когда мишень для образца помещается внутрь прибора. Как правило, распознать участок ткани под слоем матрицы не представляется возможным. Чтобы соотнести оптические изображения с образцами, сделайте направляющие метки, которые видны как на оптическом изображении, так и под матричным слоем в оптике камеры. Самый простой способ — заметить как минимум три метки корректирующей жидкости вокруг образца перед получением оптического изображения.

Чтобы распылить на матрицу с помощью ультразвукового распылителя, извлеките распыляемую ткань из эксикатора и поместите ее в камеру. Убедитесь, что салфетка не закрывает окно датчика. Начните подготовку, нажав кнопку «Старт». Обычно время на подготовку составляет около 90 минут.

Подготовка будет регулироваться автоматически с помощью контроля толщины и влажности слоя матрицы. В качестве альтернативы, чтобы распылить матричный раствор на поверхность ткани с помощью автоматического распылителя, используйте систему насоса растворителя, установленную на 10 фунтов на квадратный дюйм и 0,15 миллилитров в минуту для подачи матричного раствора.

Постоянный поток нагретого газа оболочки будет подаваться одновременно с распылением матричного раствора. Проводите эксперименты с высокой пропускной способностью и пространственным разрешением с помощью MALDI-IMS. Для масс-спектрометрических измерений определите участки тканей с помощью управляющего программного обеспечения MALDI и программного обеспечения для анализа данных.

Получение спектров в положительном линейном режиме с диапазоном отношения массы к заряду от 2 000 до 20 000 и пространственным разрешением 20 и 100 мкм. Чтобы сделать калибровочный стандарт, растворите калибровочный стандарт пептида в калибровочном стандарте белка в соотношении 1 к 4 с CHCA в растворе TA30, а затем разбавьте его в 10 раз.

Поместите 1 микролитр калибровочного стандарта на предметное стекло в четырех разных местах. Используя программное обеспечение для молекулярной гистологии, наложите несколько сигнальных изображений, чтобы найти пространственную корреляцию различных сигналов, таких как различные бета-амилоидные пептиды, колализующиеся в старческих бляшках на стенках артерий.