Выявление микрокровоизлияний в мозг на модели крысы

Церебральные микрокровоизлияния, или CMH, представляют собой нейровоспалительные кровоизлияния в мозг, вызванные нарушением гематоэнцефалического барьера, что приводит к утечке эритроцитов (эритроцитов) в ткани мозга.

Чтобы обнаружить CMH, начните с фиксированной ткани мозга крысы с CMH.

Погрузите ткань в сахарозу для криозащиты.

С помощью криомикротома разрежьте ткань и соберите срез на предметное стекло.

Вымойте для удаления остатков фиксатора.

Нанесите гематоксилин краситель, связанный с катионом металла, который взаимодействует с отрицательно заряженной ДНК, окрашивая ядро в красновато-фиолетовый цвет.

Затем нанесите кислоту-спирт, чтобы удалить излишки красителя, затем нанесите щелочное воронение, чтобы нейтрализовать кислую среду и преобразовать краситель в синюю форму, усиливая контраст.

Промойте салфетку спиртом для улучшения проникновения пятен, затем нанесите эозин для окрашивания эритроцитов в красно-оранжевый и розовый цвета компоненты ткани.

Обезвоживайте ткань с помощью повышения концентрации спирта и очистите ее ксилолом для микроскопической визуализации.

Захват изображений для обнаружения утечки эритроцитов красно-оранжевого цвета, подтверждающих CMH.

После изоляции мозга погрузите его в 20% сахарозу в PBS не менее чем на шесть часов или до тех пор, пока мозг не опустится на дно трубки. Смените раствор на 30% сахарозы, и зафиксируйте еще на шесть часов.

Наконец, подготовьте срезы мозговой ткани толщиной 10 миллиметров с помощью криостата. Начните окрашивание H&E с промывки предметных стекол в дистиллированной воде. Затем погрузить в раствор гематоксилина на восемь минут. После окрашивания постирайте в проточной воде из-под крана в течение пяти минут. Дифференцировать в 1% кислоту-спирт в течение 30 секунд.

После стирки в проточной воде из-под крана в течение одной минуты окрасьте в 0,2% воду с аммиаком или насыщенный раствор карбоната лития на срок от 30 секунд до одной минуты. Далее промойте в проточной воде из-под крана в течение пяти минут. Противопоставьте пятно раствором эозина от 30 секунд до одной минуты. Обезвоживайте через 90% спирта, затем 95% спирта и абсолютный спирт в течение 0,5-2 минут каждый.

После обезвоживания очистите в ксилоле в течение 30 секунд. После монтажа проанализируйте окрашивание H&E с помощью светлопольного флуоресцентного микроскопа. Красные кровяные тельца, высвобождающиеся из кровеносных сосудов, которые являются компонентами CMHs, появляются в красно-оранжевом цвете при окрашивании H&E.