Иммуноокрашивание нейронов, обработанных агрегатами альфа-синуклеина

Начните с адгезивной культуры нейронов, обработанной альфа-синуклеином или альфа-S агрегатами, которые представляют собой сгустки неправильно свернутого белка.

Эти сгустки агрегируются в образовку внутриклеточных включений.

Замените носитель фиксирующим раствором, чтобы сохранить целостность клеток.

Удалите фиксирующий раствор и промойте буфером.

Далее добавьте поверхностно-активное вещество для проникновения в клеточную мембрану.

Удалите поверхностно-активное вещество и промойте буфером.

Введите блокирующий раствор для предотвращения связывания неспецифических антител.

Теперь инкубируйте с первичными антителами, которые специфически связываются с альфа-S включениями и структурными белками.

Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела.

Инкубируйте с флуоресцентно меченными вторичными антителами.

Удалите несвязанные антитела.

Добавьте флуоресцентный краситель, чтобы пометить ядро.

Удалите пятно и постирайте с буфером.

С помощью монтажного материала закрепите покровное стекло с нейронами на предметном стекле

.

Под флуоресцентным микроскопом наблюдайте за иммуномечеными альфа-S включениями внутри нейрона.

Для проведения иммунофлюоресценции в химическом вытяжном шкафу фиксируют нейроны 2% параформальдегидом в ПБС и 5% раствором сахарозы на 15 минут при комнатной температуре без встряхивания. Через 15 минут удалите фиксирующий раствор, и кратко промойте нейроны PBS три раза.

Затем проникните в нейроны 0,3% неионогенного поверхностно-активного вещества в PBS в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем коротко промойте нейроны PBS три раза. Инкубируйте нейроны с 3% FBS в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере, чтобы блокировать неспецифические участки связывания. После этого инкубируйте нейроны с соответствующими первичными антителами, растворенными в 3% FBS в PBS, в течение ночи в холодной комнате или холодильнике на ночь при температуре 4 градуса Цельсия на орбитальном шейкере.

На следующий день удалите раствор антител и кратковременно промойте клетки PBS в течение трех раз. Затем инкубируйте нейроны с соответствующим флуоресцентным вторичным антителом, растворенным в 3% FBS в PBS, в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте на орбитальном шейкере.

Удалите раствор антител и кратковременно промойте PBS в течение трех раз. Далее окрашиваем нейроны раствором DAPI в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте на орбитальном шейкере. Через 15 минут удалите раствор антител и кратко промойте PBS в течение трех раз. Закрепите покровные стекла на затворе с помощью монтажной среды, предотвращающей выцветание.