Модель in vitro повреждения растяжения в индуцированных плюрипотентными стволовыми клетками нейронах человека

Начните с многолуночной бездонной пластины, прикрепленной к силиконовой мембране. Мембрана покрыта биополимером для облегчения клеточной адгезии.

Ввести индуцированные человеком нейроны, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, или hiPSCN, взвешенные в среде, в лунки. Среда дополняется внеклеточным матриксом, или белками ECM, для усиления клеточной адгезии.

Инкубируйте планшет, позволяя клеткам прилипать к белкам ECM и биополимеру, способствуя равномерному взаимодействию с поверхностью мембраны.

Далее закрепите пластину на этапе травматического устройства.

С помощью устройства нанесите углубление на мембрану, чтобы создать контролируемое механическое напряжение на нейроны.

Напряжение нарушает работу цитоскелета, что вызывает дегенерацию клеточных выступов, называемых нейритами, и образование небольших вздутий вдоль нейритов.

Стресс также нарушает целостность клеточной мембраны, что приводит к гибели клеток.

Имплантаты hiPSCN, демонстрирующие фенотип травмы растяжения, теперь готовы к анализу.

Чтобы растянуть пластину, измените поля "Имя файла" и "Путь к файлу" в виртуальном инструменте "Отслеживание положения" на уникальное имя файла и нажмите стрелку "Выполнить". Задайте глубину и продолжительность отступа в полях "Травма" и "Продолжительность травмы" в виртуальной панели управления движением. Когда пластина находится в нулевом положении, запустите виртуальный прибор «Панель управления движением» и нажмите «Травмировать», чтобы сделать отступ на пластине.

Нажмите «Вверх», чтобы переместить сцену вверх, нажмите «Стоп», когда пластина окажется в верхнем положении, и откройте дверь, чтобы отключить устройство для травмирования. Затем просмотрите историю смещений этапа, представленную в виртуальном инструменте "Трекер положения", чтобы подтвердить, что было применено указанное максимальное смещение, и экспортируйте данные в соответствующую программу для работы с электронными таблицами.

Чтобы оценить растяжение силиконовой мембраны после плазменной обработки, поместите пластину на мягкую поверхность и загрунтуйте небольшой выступ на штампе чернилами от перманентного маркера. Вставьте штамп в первую проверяемую лунку и постукивайте, чтобы убедиться в хорошем переносе чернил. Когда все скважины будут проштампованы, поместите высокоскоростную камеру на стойку стрелы над устройством травмирования, установив объектив на наименьшую пронумерованную F-ступень так, чтобы поле зрения содержало 12 инденторов в сетке 3 на 4.

Когда пластина находится в положении нулевой точки, нажмите кнопку «Запись» в программном обеспечении камеры, чтобы она показала «Trigger In», и включите яркий, рассеянный осевой свет, затем сделайте отступ на пластине, как показано только что на рисунке, и выключите осевой свет.

Чтобы повредить культуру клеток, добавьте 100 микролитров обработанных ламинином нейронов индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в каждую лунку обработанной плазмой планшета и дайте клеткам прикрепиться к дну планшета в течение 15 минут при комнатной температуре, прежде чем поместить планшет в инкубатор для клеточных культур. Через 2–3 дня культивирования зажмите пластину на ступице устройства для травмирования и отрегулируйте положение крышки, чтобы зафиксировать пластину, не подвергая культуры воздействию окружающего воздуха. Затем, когда пластина находится в положении нулевой точки, сделайте отступ на пластине, как показано на рисунке.