Измерение активации рецепторов запаха с помощью циклического анализа аденозинмонофосфата в реальном времени

Возьмите многолуночный планшет, содержащий трансфицированные клетки млекопитающих.

Эти клетки экспрессируют обонятельный рецептор (ОШ) обонятельного нейрона, рецептор, связанный с G-белком, вместе с биосенсором цАМФ, содержащим цАМФ-связывающий домен, слитый с мутантной люциферазой.

Удалите среду и промойте буфером, чтобы удалить остатки среды.

Добавьте буфер, содержащий субстрат биосенсора cAMP. Инкубируйте для облегчения усвоения субстрата клетками.

С помощью считывателя хемилюминесцентных пластин измерьте базальную люминесценцию клеток.

Добавьте в лунки возрастающие концентрации испытуемого одоранта, оставив одну лунку необработанной в качестве контрольной.

Одорант связывается с операционной и запускает сигнальный каскад, который производит цАМФ.

Этот цАМФ связывается со связывающим доменом биосенсора, активируя люциферазу, которая взаимодействует с субстратом, излучая свет.

Измеряйте люминесценцию в режиме реального времени. Увеличение люминесценции при более высоких концентрациях одоранта указывает на активацию ОШ одорантом.

Перед началом стимуляции наблюдайте за трансфицированными клетками под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться в правильном слиянии от 50% до 80% в лунке, прежде чем вернуться в инкубатор. Затем приготовьте среду для стимуляции, добавив 10 миллимолярных HEPES и 5 миллимолярных глюкоз в сбалансированный солевой раствор Хэнка. Разморозьте 55 микролитров аликвот подложки циклического анализа АМФ в реальном времени на льду.

Приготовьте 2% уравновешивающий раствор, смешав 55 микролитров реагента для субстрата и 2 750 микролитров среды для стимуляции. Расстелив на скамейке толстый слой бумажных полотенец, аккуратно и многократно постучите тарелкой вверх дном по бумажным полотенцам, чтобы трансфекционная среда впиталась бумажными полотенцами. Промойте клетки пипетированием по 50 микролитров стимулирующей среды в каждую лунку.

Аккуратно и многократно вытряхните среду для стимуляции из 96-луночного планшета. Пипеткой внесите 25 микролитров 2% уравновешивающего раствора в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 2 часов. До окончания времени инкубации разбавляют размороженные стоковые растворы одоранта до рабочей концентрации в среде стимуляции.

Перед добавлением одоранта используйте считыватель хемилюминесцентных планшетов для измерения уровня базальной люминесценции пластины. Быстро снимите пластину со считывателя тарелок и добавьте в каждую лунку по 25 микролитров разбавлений одоранта. Затем немедленно приступают к непрерывному измерению люминесценции всех лунок в течение 20 циклов в течение 30 минут.