Измерение активации рецепторов запаха с помощью циклического анализа аденозинмонофосфата в реальном времени

Возьмите многолуночный планшет, содержащий трансфицированные клетки млекопитающих.

Эти клетки экспрессируют обонятельный рецептор (ОШ) обонятельного нейрона, рецептор, связанный с G-белком, вместе с биосенсором цАМФ, содержащим цАМФ-связывающий домен, слитый с мутантной люциферазой.

Удалите среду и промойте буфером, чтобы удалить остатки среды.

Добавьте буфер, содержащий субстрат биосенсора cAMP. Инкубируйте для облегчения усвоения субстрата клетками.

С помощью считывателя хемилюминесцентных пластин измерьте базальную люминесценцию клеток.

Добавьте в лунки возрастающие концентрации испытуемого одоранта, оставив одну лунку необработанной в качестве контрольной.

Одорант связывается с операционной и запускает сигнальный каскад, который производит цАМФ.

Этот цАМФ связывается со связывающим доменом биосенсора, активируя люциферазу, которая взаимодействует с субстратом, излучая свет.

Измеряйте люминесценцию в режиме реального времени. Увеличение люминесценции при более высоких концентрациях одоранта указывает на активацию ОШ одорантом.

Перед началом стимуляции наблюдайте за трансфицированными клетками под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться в правильном слиянии от 50% до 80%