Иммунофлуоресцентное окрашивание популяций нейронов в желудочно-кишечном тракте эмбрионов мышей

Возьмите неподвижный, трансгенный эмбрион желудочно-кишечного тракта мыши на желаемой стадии развития.

Энтеральная нервная система желудочно-кишечного тракта включает в себя энтеральные нейроны и холинергические нейроны, экспрессирующие холинацетилтрансферазу.

Эти холинергические нейроны также экспрессируют флуоресцентный белок, движимый промотором холинацетилтрансферазы.

Инкубируйте тракт с неионогенным детергентом и белками для проникновения клеток и предотвращения связывания неспецифических антител.

Замените на первичные антитела. Инкубируйте антитела, чтобы связать свои целевые белки в нейронах соответственно.

Удалите несвязанные антитела и промойте буфером.

Инкубируйте с флуорофор-конъюгированными вторичными антителами для специфического связывания первичных антител, связанных с белками-мишенями.

Удалите излишки антител и промойте буфером.

Погрузите меченый тракт в монтажную среду, содержащую ядерный краситель для окрашивания ядер. Теперь установите покровную крышку.

С помощью конфокальной микроскопии визуализировать и проанализировать распределение холинергических нейронов в желудочно-кишечном тракте.

Поместите желудочно-кишечные тракты в 0,2-миллилитровую трубку, содержащую блокирующий раствор, состоящий из 1x PBS, 3% бычьего сывороточного альбумина, 0,1 Triton X-100 и рока на 1 час при комнатной температуре. После блокировки отсасывайте блокирующий раствор с помощью пастеровской пипетки с тонким наконечником и заменяйте оптимальным разведением первичных антител, разведенных в блокирующем растворе.

Инкубируйте в течение четырех часов при комнатной температуре или в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия на качающейся платформе. После первичной инкубации антител аспирировать раствор антитела и промыть желудочно-кишечные тракты в PBS три раза по пять минут каждый, а затем в течение одного часа при комнатной температуре с укачиванием.

После последней промывки замените PBS на вторичные антитела, конъюгированные с флуорофором, разведенные в блокирующем растворе, и поместите трубки на качающуюся платформу в темноте на четыре часа при комнатной температуре, или на ночь при температуре 4 градуса Цельсия.

После промывки желудочно-кишечных трактов, как и раньше, поместите несколько капель флуоресцентного монтажного материала с DAPI на предметное стекло, затем погрузите желудочно-кишечный тракт в монтажную среду и добавьте покровное стекло. Наконец, сделайте снимки каждого флуорофора с помощью конфокального микроскопа, а затем выполните компьютерный анализ изображений с использованием соответствующего программного обеспечения.