Инъекция вирусного вектора в черную субстанцию крысы для моделирования нейродегенеративных заболеваний

Закрепите крысу под наркозом в стереотаксической рамке.

Продезинфицируйте кожу головы и сделайте надрез по средней линии черепа, чтобы обнажить череп.

Определите брегму и лямбду, две опорные точки на черепе, чтобы определить место инъекции.

Приготовьте шприц для микроинъекций, содержащий суспензию вирусного вектора.

Вирусный вектор несет трансген, кодирующий альфа-синуклеин – белок, который при нейродегенеративных заболеваниях претерпевает неправильное сворачивание и агрегацию в нейронах черной субстанции.

Поместите шприц в стереотаксический инструмент, подключенный к микроинжекционному насосу.

Создайте отверстие для заусенцев в месте инъекции, избегая черепно-мозговой травмы.

Проникните в твердую мозговую оболочку иглой и очистите кровь стерильной тканью.

Вставьте иглу для микроинъекций через отверстие для заусенца, чтобы добраться до черной субстанции.

Медленно вводите вирусную суспензию, обеспечивая равномерное распределение.

Сделайте короткую паузу, чтобы предотвратить обратный поток, затем медленно извлеките иглу.

Зашить разрез.

Теперь модель готова к дальнейшему анализу.

Начните с правильной анестезии восьминедельной самки крысы Вистар в соответствии с утвержденными протоколами. Убедитесь, что хирургический план анестезии был достигнут, сдавливая каждую лапу и отмечая отсутствие рефлекса отмены. Затем с помощью имплантатора микротранспондера поместите микротранспондер на спину крысы. Убедитесь, что микротранспондер расположен правильно, и что можно получить показания.

Теперь состригите шерсть на волосистой части головы крысы и нанесите местный анестетик на кожу головы и уши. Переложите крысу в колпак для ламинарного потока, а остальную часть процедуры выполните с использованием асептической техники. Поместите крысу в стереотаксическую рамку, закрепив ушные планки, а затем ротовую и носовую планки. Накройте тело крысы бумажным одеялом, чтобы избежать падения температуры тела. Нанесите глазную смазку, чтобы предотвратить высыхание глаз.

Далее проводят дезинфекцию кожи головы согласно утвержденным процедурам. Здесь используется 1% йод в 70% изопропаноле. Сделав небольшой надрез по средней линии волосистой части головы, аккуратно соскребите оболочки на черепе, и промойте физиологическим раствором. Дав черепу высохнуть, убедитесь, что брегма и лямбда хорошо видны.

Теперь наполните 10-литровый 20-миллиметровый шприц для микроинъекций объемом 10 микролитров рекомбинантным AAV и поместите его на моторизованный насос для микроинъекций, подключенный к стереотаксическому инструменту.

Для специфической трансдукции дофаминергических нейронов черной субстанции рекомбинантные векторы AAV являются первым выбором из-за их высоких титров и эффективности для трансдукции дофаминергических нейронов.

Проверьте поток, выпустив каплю AAV. Утилизируйте любой высвободившийся AAV в поливалентном чистящем средстве. Визуально убедитесь, что голова закреплена прямо в каркасе головы. Затем убедитесь, что череп плоский, сначала переместив кончик иглы в сторону брегмы, а измерив высоту в этой точке, опустив кончик иглы в дорсовентральном направлении, пока он не коснется черепа. Повторите процедуру на лямбде.

После возвращения иглы в брегму переместите иглу в переднезаднем и медиолатеральном направлениях в стереотаксические координаты для микроинъекции. Запишите координаты. В месте инъекции измерьте высоту черепа, как и раньше, и следите за тем, чтобы она не отличалась более чем на 0,3 миллиметра от высоты брегмы.

Затем аккуратно просверлите 2-миллиметровое отверстие в черепе. После того, как отверстие просверлено, измерьте высоту твердой мозговой оболочки, чтобы определить точку отсчета, от которой следует применять дорсовентральную координату. Проникните в твердую мозговую оболочку с помощью иглы 26 калибра. Всасывайте любую кровь стерильной тканью, и приступайте только после того, как все кровотечения остановятся.

Теперь медленно опустите иглу предварительно загруженного шприца для микроинъекций в мозг до дорсальной вентральной координаты и сделайте паузу на одну минуту. Затем вводят три микролитра AAV со скоростью 0,25 микролитра в минуту. После инъекции дайте игле оставаться на месте еще пять минут, чтобы предотвратить обратный поток по дорожке иглы, прежде чем медленно удалить ее.

Прострочите кожу головы с помощью плетеного полиэстера с покрытием 3.0 и продезинфицируйте кожу 1% йодом в 70% изопропаноле, чтобы ослабить нос и ротовую дугу, а затем две ушные планки, чтобы аккуратно снять животное со стереотаксического инструмента. В это время введите анальгезию и, при необходимости, средство для отмены анестезии. Затем поместите крысу в чистую клетку на нагревательную пластину, установленную на 38 градусов по Цельсию, и внимательно наблюдайте, пока она не проснется.