Выделение нерастворимых в детергентах белковых агрегатов из посмертной ткани мозга человека

Начните с замороженного посмертного образца ткани человеческого мозга из подтвержденного случая нейродегенеративного заболевания.

Акцизирует серое вещество, богатое нерастворимыми белковыми агрегатами, являющимися отличительным признаком заболевания.

Переложите ткань в гомогенизатор.

Добавьте буфер, содержащий ингибиторы, и гомогенизируйте для высвобождения внутриклеточных компонентов.

Ингибиторы блокируют ферменты протеазы и фосфатазы, предотвращая деградацию белка.

Переложите гомогенат в пробирку и добавьте ионный буфер для детергента. Инкубировать.

Детергент растворяет нативно свернутые белки, в то время как неправильно свернутые белковые агрегаты остаются нетронутыми.

Ультразвуком до полной клеточной диссоциации.

Переложите гомогенат в ультрацентрифужную пробирку и центрифугуйте на высокой скорости.

Агрегаты оседают на дне.

Удалите надосадочную жидкость, содержащую растворимые в моющих средствах белки.

Промойте агрегаты ионным моющим буфером, центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость.

Добавьте буфер мочевины, чтобы денатурировать белковые агрегаты, делая их растворимыми.

Переложите солюбилизированные белковые агрегаты в пробирку и кратковременно обработайте ультразвуком, чтобы обеспечить полное растворение.

Получите замороженную посмертную ткань мозга от здоровых людей контрольной группы и патологически подтвержденной болезни Альцгеймера. Используйте щипцы и бритвенное лезвие, чтобы вырезать примерно 250 миллиграммовых порций серого вещества из каждого образца ткани. Дайте сегменту мозга оттаять в течение одной минуты. Теперь нарежьте кусок ткани кубиками примерно по два миллиметра, пока он оттаивает. Переложите в двухмиллилитровую предварительно охлажденную гомогенизаторную трубку со льдом.

Не забывайте избегать белого вещества и любых крупных кровеносных сосудов.

Работайте быстро и поместите салфетку на слезные одноразовые весы лодочек. Следите за тем, чтобы ткань не оттаивала, часто помещая весовую лодку с мозговой тканью в контейнеры из полистирола с сухим льдом. После вскрытия и взвешивания всех необходимых кусочков ткани извлеките из сухого льда весовую лодку, содержащую кусок ткани.

Затем добавьте пять миллилитров ледяного буфера с низким содержанием соли с протеазой и ингибитором фосфатазы на грамм ткани и гомогенизируйте на льду, используя примерно 10 ударов пестика с высоким клиренсом А и 15 ударов пестика с низким клиренсом В. Затем с помощью девятидюймовой стеклянной пипетки Пастера перенесите каждый гомогенат в промаркированную двухмиллилитровую полипропиленовую пробирку. Распределите оставшийся гомогенат в дополнительно маркированные 1,5-миллилитровые пробирки аналогичным образом для хранения при температуре -80 градусов Цельсия.

Чтобы приступить к фракционированию, добавьте 100 микролитров пяти моляров хлорида натрия и 100 микролитров 10% саркозила в каждую 0,8-миллиметровую аликвоту. Хорошо перемешайте путем инверсии, а затем выдерживайте на льду в течение 15 минут. После инкубации используйте ультразвуковую терапию, оснащенную зондом с микронаконечником, чтобы подать три 5-секундных импульса с амплитудой 30%.

После использования метода бицинхониновой кислоты для определения концентраций белков гомогенатов добавьте ледяной буфер сарка с ингибиторами протеазы и фосфатазы в каждый образец до конечной концентрации 10 миллиграммов на миллиметр. Затем перелейте 500 микролитров каждого образца в ультрацентрифужные пробирки из поликарбоната объемом 500 микролитров.

Загрузите пробирки в предварительно охлажденный ротор и ультрацентрифугируйте при 180 000 умноженных на g в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия. После центрифугирования переложите растворимую в саркозиле надосадочную жидкость S1 в пробирки объемом 1,5 миллилитра и храните при температуре -80 градусов Цельсия. Добавьте 200 микролитров буфера сарка в ультрацентрифужные пробирки, содержащие нерастворимые фракции Р1 моющего средства, и с помощью наконечника пипетки вытесните гранулы со дна ультрацентрифужных пробирок.

Затем перенесите ресуспендированные гранулы P1 в новые ультрацентрифужные пробирки объемом 500 микролитров, уравновесьте пару и центрифугируйте при 180 000 умноженных на g в течение дополнительных 30 минут при 4 градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость S2, затем добавьте от 50 до 75 микролитров буфера мочевины с протеазой и коктейлем ингибиторов фосфатазы в нерастворимые саркозил гранулы и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре для растворения гранул P2.

После инкубации перенесите ресуспендированные гранулы P2 в помеченные 0,5-миллиметровые пробирки и полностью растворите гранулы с помощью короткой 1-секундной ультразвуковой обработки микронаконечником с амплитудой 20%. Определение концентраций белков саркозильных растворимых и нерастворимых саркозиловых фракций с помощью метода анализа ВСА.