Обнаружение колокализации орексина и каннабиноидных рецепторов у индуцированных диетой рыбок данио-рерио

В мозге рыбок данио нейроны экспрессируют орексин и каннабиноидные рецепторы, которые регулируют обмен веществ.

У рыбок данио-рерио, страдающих ожирением, вызванным диетой, эти рецепторы все чаще колокализуются, образуя гетеромеры, изменяя нисходящую сигнализацию и влияя на метаболическую регуляцию.

Возьмите криорезы тканей мозга как у контрольной рыбки, так и у рыбок данио-рерио. Промойте секции буфером, чтобы удалить заделывающую среду.

Обработайте буфером, блокирующим пермеабилизацию, для проникновения в клеточные мембраны и маскировки неспецифических сайтов связывания. Промойте, чтобы удалить излишки буфера.

Инкубируйте с первичным коктейлем антител, нацеленным на рецепторы. Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Инкубируйте с различными вторичными антителами, меченными флуорофорами, которые связываются с первичными антителами. Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Добавьте флуоресцентный ДНК-связывающий краситель для маркировки ядра. Затем нанесите монтажный материал и загерметизируйте секции покровным стеклом.

С помощью конфокального микроскопа обнаружить флуоресценцию антител. Повышенная колокализация антител у рыбок данио DIO по сравнению с контрольной группой указывает на более высокую гетеромеризацию рецепторов.

Сначала промойте срезы три раза по 5 минут каждый 0,1 молярного фосфатного буфера. Добавьте смесь первичных антител к лютециевому ПБТ и инкубируйте срезы в течение ночи во влажной коробке при комнатной температуре. На следующий день промойте срезы три раза по 5 минут каждый 0,1 молярного фосфатного буфера. Инкубируйте срезы при комнатной температуре в течение 2 часов в соответствующей смеси вторичных антител, разведенных в ПБТ.

Промойте срезы три раза по 5 минут каждый 0,1 молярного фосфатного буфера. Растворите 1,5 микролитра DAPI в 3 миллилитрах фосфатного буфера для приготовления ядерного красителя DAPI. Закрасьте участки красителем, затем используйте монтажную среду для прикрытия стекол, чтобы стабилизировать ткань и нанести краску для длительного использования. Флуоресцентные образцы можно хранить в темноте при температуре 4 градуса Цельсия.