Изучение проникновения FITC и FITC-ферритина с помощью модели гематоэнцефалического барьера in vitro

Начните с многолуночного планшета, содержащего модель гематоэнцефалического барьера in vitro или ГЭБ.

Эта модель состоит из эндотелиальных клеток, прикрепленных к верхней, или кровеносной, стороне, и астроцитов на нижней, или мозговой, стороне мембраны, покрытой матрицей.

Добавьте флуоресцеин изотиоцианат или ФИТК, флуоресцентный краситель, в верхнюю камеру контрольной лунки.

И наоборот, добавьте ферритин, загруженный FITC, или ферритин FITC, в верхнюю камеру лунки для образца и затем инкубируйте.

В контрольной лунке свободный FITC остается ограниченным в верхней камере, с минимальным проходом через ГЭБ.

Между тем, в лунке образца комплексы FITC-ферритин связываются с рецепторами на эндотелиальных клетках.

Это обеспечивает рецептор-опосредованную интернализацию и транспортировку в нижнюю камеру.

Далее регулярно собирайте среду из нижних камер обеих лунок и измеряйте интенсивность флуоресценции.

Контрольная группа демонстрирует более низкую флуоресценцию, в то время как образец демонстрирует более высокую флуоресценцию, подтверждая дифференциальную проницаемость BBB для FITC и FITC-ферритина.

Чтобы измерить поток FITC-ферритина через систему гематоэнцефалического барьера, добавьте фарритин, загруженный FITC, или свободный FITC в верхнюю часть по меньшей мере трех систем гематоэнцефалического барьера для каждой состава.

Через семь часов в инкубаторе извлеките 2 миллилитра среды из нижних камер трех проб и контрольных вкладышей. Измерьте интенсивность флуоресценции 500 микролитров собранных образцов с помощью спектрофлуориметра и определите концентрацию проникающего FITC или FITC-ферритина в соответствии с инструкциями в письменной части протокола.