Изучение накопления альфа-синуклеина в первичных эмбриональных дофаминовых нейронах мышей

Возьмите микроостровные культуры первичных эмбриональных дофаминовых нейронов мыши в многолуночном планшете, содержащем среду.

Эти нейроны предварительно обрабатываются предварительно сформированными фибриллами (PFF) — неправильно свернутыми и агрегированными формами белка альфа-синуклеина.

PFF действуют как семена, вызывая дальнейшее неправильное сворачивание и олигомеризацию эндогенного альфа-синуклеина, образуя фосфорилированные фибриллы альфа-синуклеина. Эти фибриллы со временем образуют тельца Леви.

Замените среду фиксатором для сохранения клеточной морфологии.

Промойте ячейки буфером.

Введите буфер, содержащий детергент, для проникновения в клеточные мембраны.

Добавьте блокирующий раствор для предотвращения связывания неспецифических антител.

Добавьте первичные антитела, нацеленные на фосфорилированный альфа-синуклеин, и референсный белок, повсеместно экспрессируемый в дофаминовых нейронах.

Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Введение флуорконъюгированных вторичных антител, нацеленных на соответствующие первичные антитела.

Промойте еще раз, чтобы удалить несвязанные антитела.

Добавьте ДНК-связывающий краситель для окрашивания ядер.

С помощью сканера флуоресцентных пластин количественно определите количество дофаминовых нейронов, содержащих цитоплазматические агрегаты альфа-синуклеина.

Добавьте 3,75 микролитра 100 микрограмм на миллилитр предварительно сформированных фибрилл в каждую экспериментальную лунку и 3,75 микролитра PBS в каждую контрольную лунку.

При работе с PFF будьте осторожны с нежелательным загрязнением белка, а затем очистите кожух и все инструменты, связанные с PFF, 1% SDS и 70% этанола.

В соответствующей экспериментальной конечной точке, после окрашивания для интересующих маркеров, загрузите культуральный планшет 96 лунки на сканер с высоким содержанием жидкости, оснащенный объективом с 10-кратным увеличением. Отрегулируйте настройки в соответствии со спецификациями 96-луночной пластины, такими как тип пластины, производитель, размер, расстояние между лунками, а также тип и объем среды.

Выберите область визуализации лунок, чтобы охватить все ячейки в каждом микроостровке, и используйте одну лунку для настройки автофокусировки по выражению DAPI. Откалибруйте время регистрации для каждого флуоресцентного канала, основываясь на интенсивности окрашивания в контрольных лунках, и отрегулируйте параметры таким образом, чтобы дофаминовые клетки в предварительно обработанных фибриллами контрольных лунках, содержащих агрегаты фосфосерина 129 альфа-синуклеина в соме клеток, были четко различимы, что позволяет однозначно количественно оценить фосфосерин альфа-синуклеин, положительные и отрицательные клетки.

Затем визуализируйте все выбранные скважины одновременно во всех каналах, используя точно такие же параметры для каждой скважины.