Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 3:47 мин. • July 8th, 2025
Принимайте перфузированные ишемизированные ткани мозга мыши, содержащие клетки мозга и инфильтрированные иммунные клетки.
Пропустите салфетки через ситечко и промойте буфером.
Центрифугируйте фильтрат и выбросьте надосадочную жидкость.
Повторно суспендируйте гранулу в растворе пищеварительного фермента и переложите ее в микроцентрифужную пробирку.
Инкубируйте пищеварительные ферменты, чтобы расщепить внеклеточный матрикс, разрыхляя клетки.
Отфильтруйте суспензию и промойте буфером, содержащим ДНКазу, чтобы удалить загрязняющую ДНК.
Затем промойте буфером, не содержащим DNase.
Центрифугируйте фильтрат и выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте клетки в среде с градиентом плотности. Затем переложите содержимое в свежую пробирку и перемешайте. Центрифуга для разделения компонентов по плотности.
Удалите надосадочную жидкость, содержащую миелин и мусор.
Ресуспендируйте гранулу в буфере, не содержащем ДНКазы. Переложите его в новую пробирку и снова центрифугите.
Выбросьте надосадочную жидкость, чтобы обеспечить достаточное удаление градиента плотности среды.
Наконец, снова суспендируйте ячейки в буфере для дальнейшего анализа.
С помощью поршневого конца 5-миллилитрового шприца разомните кусочки мозговой ткани через 100-микронный клеточный фильтр, непрерывно промывая фильтр ледяным HBSS с кальцием и магнием. Затем поместите гомогенизированные ткани на лед.
Когда все образцы будут обработаны, раскрутите клеточные суспензии. И аккуратно отбраковывайте надосадочную жидкость. Суспендируйте гранулы в 1 миллилитр буфера для метантенка. Затем переложите клеточную суспензию в 2-миллилитровую пробирку.
И инкубируйте клетки при медленном непрерывном вращении при температуре 37 градусов Цельсия. Через час просейте клеточную суспензию через сетчатое фильтр с плотностью 70 микрон. И тщательно промойте фильтр 3 миллилитрами промывочного буфера, содержащего ДНКазу. Затем промойте ситечко 15 миллилитрами буфера для стирки, не содержащего ДНКазы. Раскрутите клетки вниз и выбросьте надосадочную жидкость.
Чтобы удалить клеточный мусор и миелин, повторно суспендируйте клетки в 5 миллилитров среды с градиентом плотности 25% комнатной температуры и переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку. Тщательно перемешайте ячейки и градиент с помощью многократного аккуратного пипетирования. Затем раскрутите клеточный раствор.
По окончании сепарации осторожно аспирируйте миелиновую оболочку и надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. И ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах буфера для промывки, не содержащего ДНКазы. Переложите ячейки в 15-миллилитровую трубку и снова раскрутите их, повторно суспензив гранулу в 100 микролитрах холодного буфера для промывки.