Обнаружение старения нейронов в корковом органоидном отделе

Начните со слайда, содержащего тонкий срез кортикального органоида, который содержит глиальные клетки и нейроны на различных стадиях старения.

Стареющие нейроны, находящиеся в состоянии старения со снижением клеточной функции, содержат высокие уровни бета-галактозидазы.

Срез предварительно обрабатывают фиксатором для стабилизации клеточной структуры и проникающим агентом для проникновения в их мембраны.

Поместите предметное стекло в емкость для окрашивания и постирайте с буфером, чтобы удалить следы раствора.

Окрасьте предметное стекло раствором, содержащим субстрат для фермента бета-галактозидазы, и инкубируйте.

Субстрат попадает в клетки, где бета-галактозидаза расщепляет субстрат, производя продукт синего цвета, который накапливается больше в стареющих нейронах.

Многократно промойте участок.

Добавьте крепление с защитой от выцветания и дайте ему застыть, обеспечив целостность окрашенного участка.

Понаблюдайте за предметным стеклом под микроскопом; область с интенсивным синим цветом указывает на старение нейронов внутри органоида.

После криоссекции органоидов удалите излишки монтажного раствора, переложив предметные стекла в стоячую емкость с крышкой, и трижды промойте разрезанную органоидную ткань PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с помощью свежеприготовленного раствора для окрашивания бета-галактозидазы. Промойте испачканные ткани три раза PBS в течение 10 минут каждый при комнатной температуре, чтобы удалить раствор бета-галактозидазы.

Теперь смонтируйте промытые салфетки с помощью стеклянного монтанта с защитой от выцветания и дайте монтажному раствору застыть в течение 30 минут при комнатной температуре, прежде чем рассматривать его под микроскопом.