Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 2:36 мин. • July 8th, 2025
Возьмем фиксированный участок гиппокампа крысы, содержащий интернейрон, заполненный биоцитином, молекулой, конъюгированной с биотином.
Затем добавьте раствор, содержащий блокирующие белки и неионогенное моющее средство, чтобы предотвратить неспецифическое связывание и проникнуть в нейроны.
Инкубируйте с первичным антителом, нацеленным на специфические каннабиноидные рецепторы на интернейронах.
Промойте буфером, чтобы удалить излишки антител.
Затем добавьте стрептавидин-конъюгированный флуоресцентный краситель и флуорофор-конъюгированное вторичное антитело.
Во время инкубации стрептавидин прочно связывается с биоцитином, позволяя визуализировать заполненный биоцитином интернейрон, в то время как вторичное антитело нацелено на связанные с рецепторами первичные антитела на интернейронах.
Промойте буфером, удаляя несвязанные молекулы.
Теперь смонтируйте секцию с помощью водного монтажного материала. Установите покровное стекло и запечатайте его.
Используя флуоресцентный микроскоп, визуализируйте заполненный биоцитином интернейрон и экспрессию каннабиноидных рецепторов, что позволяет анализировать морфологию интернейрона и распределение рецепторов.
Заблокируйте ткани 10% блокирующей сывороткой на один час при комнатной температуре. Затем инкубируют участки первичного антитела CB1R при комнатной температуре в течение ночи, чтобы определить экспрессию каннабиноидного рецептора первого типа. Затем промойте участки мозга три раза по 10 минут каждый по 0,1 молярного PBS. Стрептавидин и вторичное антитело к первому первичному антителу добавляют в луночный планшет и выдерживают в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.
Затем инкубируйте срезы в конъюгате стрептавидина с красным красителем при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи в темноте, чтобы выявить биоцитин. После этого промойте участки мозга три раза по 10 минут каждый по 0,1 моляра PBS. Для защиты флуоресценции и облегчения фиксации в будущем установите секции в монтажную среду на водной основе и заклейте края покровных стекол прозрачным лаком для ногтей.