Иммуногистохимическое окрашивание белка S-100 в срезах ректальной аспирационной биопсии человека

Возьмите несъемные биопсию ректальной аспирации человека с экспонированными белковыми антигенами и инактивированными эндогенными пероксидазами.

Добавьте блокирующий раствор для предотвращения связывания неспецифических антител.

Замените блокирующий раствор первичными антителами, которые связываются с белком глиальных клеток-мишени, S-100, маркером болезни Гиршпрунга.

Удалите несвязанные антитела и инкубируйте с полимерами пероксидазы для усиления сигнала.

Вымойте для удаления излишков полимера. Добавляйте вторичные антитела, которые связываются с ферментными полимерами и первичными антителами.

Удалите несвязанные антитела и добавьте хромогенный субстрат.

Пероксидазы вступают в реакцию с субстратом, образуя окрашенный осадок.

Промойте для удаления излишков осадка.

Добавьте краситель для окрашивания ядер.

Постирайте кислотно-этаноловым раствором, чтобы удалить излишки красителя.

Затем обезвоживайте срезы с помощью возрастающей концентрации этанола, а затем ксилола.

Наконец, установите и наблюдайте под микроскопом, чтобы визуализировать окрашивание, указывающее на присутствие целевого белка.

Выбросьте избыток бычьего сывороточного альбумина и пометьте клетки 50 микролитрами первичного антитела, представляющего интерес, при температуре 4 градуса Цельсия на ночь. На следующее утро промойте слайды тремя трехминутными промывками в PBS и добавьте 50 микролитров полимерного усилителя на каждую слайд. Через 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия трижды промойте предметные стекла в PBS и добавьте по 50 микролитров вторичного антитела В на каждый участок ткани.

Через 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия промойте секции тремя пятиминутными промывками в PBS, и добавьте каплю свежеприготовленного рабочего раствора DAB на каждую горку. Когда с помощью световой микроскопии будет обнаружен соответствующий уровень коричневого окрашивания, промывайте предметные стекла в PBS в течение пяти минут, а ядра контрокрашивайте одной каплей гематоксилина в течение одной минуты.

Удалите излишки пятна под струйкой воды в течение примерно 30–40 секунд, а затем простирайте в течение 25–30 секунд в свежем PBS. Дифференцируйте ткани в этаноле с 1% соляной кислотой в течение 10 секунд, а затем промывайте их в течение одной минуты.

Обезвоживайте слайды с помощью пятиминутных погружений в порядке, обратном гидратации, и подвергайте слайды двум пятиминутным изменениям ксилола. Затем установите покровное стекло с помощью ультрачистого крепления и дайте предметным стеклам высохнуть, прежде чем они будут визуализированы на световом микроскопе.