JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:02 мин • July 8th, 2025
Возьмите несъемные биопсию ректальной аспирации человека с экспонированными белковыми антигенами и инактивированными эндогенными пероксидазами.
Добавьте блокирующий раствор для предотвращения связывания неспецифических антител.
Замените блокирующий раствор первичными антителами, которые связываются с белком глиальных клеток-мишени, S-100, маркером болезни Гиршпрунга.
Удалите несвязанные антитела и инкубируйте с полимерами пероксидазы для усиления сигнала.
Вымойте для удаления излишков полимера. Добавляйте вторичные антитела, которые связываются с ферментными полимерами и первичными антителами.
Удалите несвязанные антитела и добавьте хромогенный субстрат.
Пероксидазы вступают в реакцию с субстратом, образуя окрашенный осадок.
Промойте для удаления излишков осадка.
Добавьте краситель для окрашивания ядер.
Постирайте кислотно-этаноловым раствором, чтобы удалить излишки красителя.
Затем обезвоживайте срезы с помощью возрастающей концентрации этанола, а затем ксилола.
Наконец, установите и наблюдайте под микроскопом, чтобы визуализировать окрашивание, указывающее на присутствие целевого белка.
Выбросьте избыток бычьего сывороточного альбумина и пометьте клетки 50 микролитрами первичного антитела, представляющего интерес, при температуре 4 градуса Цельсия на ночь. На следующее утро промойте слайды тремя трехминутными промывками в PBS и добавьте 50 микролитров полимерного усилителя на каждую слайд. Через 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия трижды промойте предметные стекла в PBS и добавьте по 50 микролитров вторичного антитела В на каждый участок ткани.
Через 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия промойте секции тремя пятиминутными промывками в PBS, и добавьте каплю свежеприготовленного рабочего раствора DAB на каждую горку. Когда с помощью световой микроскопии будет обнаружен соответствующий уровень коричневого окрашивания, промывайте предметные стекла в PBS в течение пяти минут, а ядра контрокрашивайте одной каплей гематоксилина в течение одной минуты.
Удалите излишки пятна под струйкой воды в течение примерно 30–40 секунд, а затем простирайте в течение 25–30 секунд в свежем PBS. Дифференцируйте ткани в этаноле с 1% соляной кислотой в течение 10 секунд, а затем промывайте их в течение одной минуты.
Обезвоживайте слайды с помощью пятиминутных погружений в порядке, обратном гидратации, и подвергайте слайды двум пятиминутным изменениям ксилола. Затем установите покровное стекло с помощью ультрачистого крепления и дайте предметным стеклам высохнуть, прежде чем они будут визуализированы на световом микроскопе.
В данной статье представлен протокол иммуногистохимического окрашивания срезов биопсии прямой кишки человека для обнаружения белка S-100 — маркера, ассоциированного с болезнью Гиршпрунга. Метод включает несколько этапов, в том числе блокировку, инкубацию с антителами и методы визуализации для выявления присутствия целевого белка.
Иммуногистохимическое окрашивание на белок S-100 в срезах ректальной присасывающей биопсии обеспечивает надежный количественный анализ наличия глиальных клеток, что напрямую способствует валидации мишеней при энтеральных нейропатиях, таких как болезнь Гиршпрунга. Данный рабочий процесс позволяет проводить стандартизированную, воспроизводимую оценку образцов тканей, обеспечивая уверенное снижение биологических рисков и сопоставимость результатов различных исследований. Интеграция таких валидированных маркеров укрепляет механизмы ранней диагностики и трансляционных исследований в области нейрогастроэнтерологии.
Данный протокол иммуногистохимического анализа применим на этапах от раннего поиска до доклинической валидации, обеспечивая стандартизированный метод подтверждения мишеней и биомаркеров в образцах тканей человека.
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026