Индуцирование целевого повреждения нейронов с помощью мощного лазера у личинки дрозофилы

Поместите находящуюся под наркозом личинку дрозофилы головой вверх на масляную каплю на предметное стекло, содержащее пятна вакуумной смазки.

Установите покровный лист и осторожно нажмите на него, чтобы соприкоснуться с личинкой.

Отрегулируйте личинку так, чтобы обнажить область, содержащую целевые нейроны, экспрессирующие флуоресцентные белки.

Закрепите предметное стекло на двухфотонном микроскопе.

Используйте маломощный лазер, чтобы свести к минимуму повреждения, и просканируйте личинку, чтобы найти область с флуоресцентными нейронами-мишенями.

Затем настройте окно сканирования так, чтобы оно сфокусировалось на целевой области, содержащей аксоны, тип нейронных проекций.

Теперь уменьшите скорость сканирования и увеличьте мощность лазера.

Мощный лазер будет воздействовать на целевые аксоны, генерируя локализованное тепло, которое повреждает их и усиливает флуоресценцию вокруг места повреждения.

Наконец, переключитесь обратно в режим маломощного лазера. Наличие небольших кратеров, кольцеобразных структур в месте повреждения подтверждает успешное повреждение нейронов.

Начните с обезболивания личинок. В вытяжной шкаф поместите стеклянную чашку диаметром 60 миллиметров в пластиковую чашку Петри диаметром 15 сантиметров. Затем сложите лист папиросной бумаги и положите его в стеклянную посуду. Поместите пластину с виноградным агаром на ткань после добавления диэтилового эфира. Затем на предметное стекло нанесите одну каплю масла галоидоуглерода 27 в центр и нанесите по пятну вакуумной смазки на каждый из четырех углов.

Затем с помощью щипцов перенесите одну личинку на агаровую пластину и накройте стеклянную посуду, чтобы обезболить личинку. Как только личинка перестанет двигаться, осторожно перенесите ее на галоидоуглеродное масло с поднятой головой. Затем наденьте на предметное стекло покровный стекло и осторожно прижмите его, пока он не коснется личинки. Затем с осторожной силой сдвиньте покровное стекло, чтобы свернуть ячейки, которые будут абляционированы, туда, где двухфотонный лазер будет легче всего их поразить. Местоположение будет варьироваться в зависимости от того, на какие нейроны нацелены.

Теперь закрепите сборку на предметном столике двухфотонного микроскопа и сосредоточьтесь на интересующих клетках с помощью 40-кратного масляного иммерсионного объектива. В программном обеспечении переключитесь в режим сканирования, и загрузите сохраненный протокол. Убедитесь, что отверстие открыто до упора. Затем, в режиме Live, получите хорошее изображение интересующего региона. Далее остановите сканирование в реальном времени, чтобы кнопка «Обрезать» стала доступна. С помощью функции «Обрезка» отрегулируйте окно сканирования так, чтобы сфокусировать целевую область только на предполагаемом месте травмы.

Затем откройте новое окно изображения. Теперь уменьшите скорость сканирования и увеличьте интенсивность лазера. Затем переключайте непрерывную кнопку, чтобы начать и остановить сканирование. Внимательно наблюдайте. Как только произойдет резкое увеличение флуоресценции, завершите сканирование. Затем переключитесь обратно в исходное окно изображения, выберите режим Live и найдите область, которая только что была выбрана, настроив фокус.

Хорошим признаком успешной травмы является появление небольшого кратера, кольцевидной структуры или локализованных обломков прямо на месте травмы. Если бы мощность лазера была слишком высокой, была бы видна большая область поражения, которая может привести к летальному исходу.