Иммуногистохимия для идентификации области locus coeruleus в срезах мозга мыши

Области locus coeruleus, расположенные с обеих сторон в стволе мозга мыши, содержат нейроны, продуцирующие норадреналин, и регулируют различные области мозга.

Чтобы обнаружить эти области locus coeruleus, начните со стеклянного предметного стекла, на котором будут размещены неподвижные, криоконсервированные участки ствола мозга мыши.

Промойте предметное стекло буфером, чтобы удалить фиксирующие следы.

Добавьте буфер, содержащий моющее средство, и инкубируйте для проникновения мембран, затем вымойте.

Введение первичных антител, специфичных к ферменту допамин-β-гидроксилазе, который превращает дофамин в норадреналин, нейромедиатор.

Инкубируйте, чтобы антитела взаимодействовали с дофамин β гидроксилазой.

Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Затем добавьте зеленые вторичные антитела, связанные с флуорофорами, и инкубируйте в темноте.

Вторичные антитела связываются с первичными антителами, а затем вымываются.

Добавьте монтажную среду на участки мозга, затем накройте крышкой и высушите.

Понаблюдайте за предметными стеклами под флуоресцентным микроскопом.

Зеленая флуоресценция, представляющая меченые норадреналиновые нейроны в отделах мозга, указывает на наличие областей locus coeruleus.

В первый день промойте срезы мозга в 24-луночной тарелке 3 раза по 5 минут каждый в PBS. Затем добавьте 0,5% PBS с моющим средством и пермеабилизируйте их при температуре 4 градуса Цельсия в течение 24 часов.

На следующий день промойте ломтики три раза по 5 минут каждый 0,5% PBSD. Затем добавьте первичное антитело в разведении от 1 до 500 в 0,5% PBSD и инкубируйте при температуре 4 градуса Цельсия в течение 18 часов.

На 3-й день промойте ломтики 3 раза по 10 минут каждый с 0,5% PBSD. Затем добавьте вторичное антитело в разведении от 1 до 1000 в 0,5% PBSD. Оберните тарелку алюминиевой фольгой и выдерживайте при температуре 4 градуса Цельсия в течение 16 часов.

После инкубации промойте ломтики 3 раза по 5 минут каждый с 0,5% PBSD, а затем в течение 5 минут в PBS. Закройте секции с помощью жестко установленного монтажного носителя без DAPI. Накрываем стеклянной крышкой и сушим в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем используйте конфокальный микроскоп с настройками для обнаружения сигнала от соответствующей длины волны флуоресценции для получения изображений срезов мозга.