Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 6:31 мин. • July 8th, 2025
Соберите медиальную ганглионарную ткань возвышения, содержащую предшественников кортикальных интернейронов, из генетически модифицированных эмбрионов мышей.
Добавьте катионный полимер и диссоциируйте ткань в одноклеточную суспензию.
Добавьте лентивирусные векторы, несущие репортер GFP, зависящий от Cre-рекомбиназы, окруженный сайтами lox. Инкубировать.
Полимер нейтрализует заряды вируса и мембраны клетки-хозяина, обеспечивая слияние вирусов и высвобождение РНК.
Вирусная РНК перезаписывается и интегрируется в геном хозяина.
Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Впитывают излишки среды.
Перенесите клетки на гидрофобную поверхность и загрузите их в инъекционное устройство.
Введите клетки в кору головного мозга мышиного щенка, находящегося под наркозом.
Дайте щенку восстановиться и вырасти.
Трансплантированные предшественники дифференцируются в зрелые интернейроны в коре головного мозга.
Подгруппа этих интернейронов совместно экспрессирует Cre-рекомбиназу и RFP.
В этих интернейронах Cre вырезает участки LOX, переворачивая ген GFP и обеспечивая его экспрессию.
Визуализируйте совместную экспрессию RFP и GFP для идентификации интернейронов, экспрессирующих Cre.
После подготовки лентивируса и препарирования MGE в соответствии с указаниями в письменном протоколе соберите оба полушария MGE и поместите ткань в две 1,5-миллилитровые пробирки для сбора, содержащие 500 микролитров DMEM с 10% FBS.
Держите образцы на льду до тех пор, пока не будут собраны все ткани. Затем переложите пробирки в колпак, сертифицированный по стандарту BSL-2. Осторожно отсасывайте среду, не нарушая ткани MGE, расположившиеся на дне трубки.
Затем добавьте около 500 микролитров предварительно подогретого DMEM с 10% FBS средой. Добавьте полибрен до конечной концентрации 8 микрограммов на миллилитр и титруйте через наконечник пипетки P1000 до получения одноклеточной суспензии. Затем добавьте от 15 до 20 микролитров концентрированного лентивируса в каждую пробирку.
Далее надежно закройте каждую пробирку, переверните для перемешивания, а затем поместите все пробирки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Инкубируйте клетки с лентивирусом не менее 30 минут, но не дольше часа, так как более длительное время приводит к снижению жизнеспособности клеток. Переворачивайте трубки каждые 10 минут.
После инкубации извлеките пробирки из инкубатора и центрифугируйте при 700-кратном g при 4 градусах Цельсия в течение трех минут, чтобы гранулировать клетки. В капюшоне BSL-2 удалите надосадочную жидкость и выбросьте до 10% отбеливателя. Далее добавьте 1 миллилитр DMEM с 10% FBS, и титруйте гранулу два-три раза для стирки.
После центрифугирования, как и раньше, повторите этот этап промывки еще два-три раза, чтобы удалить излишки вируса. После окончательной промывки удалите как можно больше среды, и положите каждую трубку на лед.
Из-за остаточной среды по бокам пробирки к моменту начала процедуры трансплантации примерно от 2 до 3 микролитров среды покроют клеточную гранулу. Убедившись, что на всем протяжении используется стерильная техника, наберите минеральное масло в 1-миллилитровый шприц, а затем с помощью иглы 30,5 калибра полностью заполните стеклянную пипетку минеральным маслом.
Далее прикрепите стеклянную пипетку к стереотаксическому устройству и загрузите на поршень. С помощью помощника, использующего гидравлический привод, переместите поршень примерно наполовину в стеклянную пипетку, удаляя вылитое минеральное масло чистым бумажным полотенцем.
Затем скрутите угол стерильного бумажного полотенца в тонкое острие и используйте его для деликатного удаления излишков среды над клеточной гранулой MGE. Это позволит сконцентрировать плотность клеток, что позволит достичь меньших объемов инъекций.
Затем с помощью пипетки P2 медленно наберите клеточную гранулу и титруйте один-два раза, прежде чем нанести на гидрофобную поверхность. Объем должен составлять чуть менее 1 микролитра.
Переместите кончик иглы в клеточную суспензию, и с помощью гидравлического привода втяните клеточную суспензию в пипетку. После обезболивания щенка с помощью гипотермии проверьте эффективность анестезии, защемляя щипцами кожу между пальцами ног. Никакой реакции не должно быть видно.
Затем поместите щенка на форму, которая находится под устройством для инъекций, и сделайте кожу натянутой, оттянув кожу на голове, а затем закрепив ее стандартной лабораторной лентой. Работая быстро, манипулируйте стереотаксической рукой, чтобы расположить кончик стеклянной пипетки на голове щенка, перпендикулярно поверхности головы.
Когда пипетка соприкасается с головкой, считайте, что это ноль. Далее протолкните пипетку через поверхность кожи и черепа в кору головного мозга. Затем вставьте и втяните пипетку два раза, прежде чем остановить.
Для нацеливания клеток в неокортекс инъекции проводятся, когда микропипетка находится на глубине 0,1 миллиметра. Как только игла будет на месте, поверните гидравлическое устройство, чтобы продвинуть поршень в стеклянную пипетку, и введите от 50 до 70 нанолитров на каждый участок.
Повторите эту процедуру на трех-шести различных участках на разных рострально-каудальных уровнях, если требуется широкое распределение трансформированных клеток по всему неокортексу. Когда инъекции будут завершены, снимите щенка со сцены и пометьте его в соответствии с утвержденными процедурами.
Как только щенок выздоровеет и сможет самостоятельно передвигаться, посадите его обратно вместе с кормящей самкой и остальным пометом. Проверьте щенков после процедуры и на следующий день, чтобы убедиться в отсутствии признаков ухудшения здоровья.