Матричная модель опухолевой инвазии с использованием кокультуры глиобластомы микроглии

Начните с добавления холодной суспензии глиобластомы и клеток микроглии, каждая из которых окрашена отдельным флуоресцентным красителем, в холодный раствор полимерной матрицы.

Холодное состояние предотвращает преждевременную полимеризацию матрицы.

Затем переложите смесь в пористую камеру, вставьте ее внутрь культуральной пластины.

Инкубируйте для полимеризации матрикса, образуя гель, который встраивает клетки.

Добавьте не содержащую сыворотки среду во вкладыш и питательную среду, содержащую сыворотку, в расположенную ниже лунку, затем инкубируйте.

Химические факторы в сыворотке способствуют миграции клеток в богатые сывороткой среды.

Кроме того, микроглия выделяет сигнальные молекулы, которые взаимодействуют с клетками глиобластомы.

Это усиливает миграцию клеток глиобластомы в нижнюю часть пористого вкладыша, напоминая их миграцию из опухоли в окружающие ткани.

Удалите ячейки с верхней части камеры.

Теперь зафиксируйте оставшиеся ячейки фиксатором и промойте их буфером. Отчетливая флуоресценция клеток помогает отслеживать миграцию клеток.

Разморозьте матричную смесь при четырех градусах Цельсия на ночь. Далее приготовьте концентрацию матрицы 10 мг/мл в соответствующей среде на льду. Затем соберите помеченные клетки для суспензии в матрице, как показано ранее. Затем пипетку в 1,5 раза по 10 до пятой части GL261 в объеме 150 микролитров, плюс в пять раз по 10 до четвертой клетки микроглии в объеме 50 микролитров в 1,5-миллилитровую микропробирку.

Добавьте 2 раза по 10 к пятой части клетки GL261 в объеме 200 микролитров в отдельную микропробирку объемом 1,5 миллилитров. Вращайте клетки в микрофуге в течение пяти минут при 120-кратном избежании. Затем повторно суспендируйте клетки в 200 микролитрах холодной матрицы на льду.

Для этого шага крайне важно иметь наготове поддон для льда в вытяжке. Храните трубочки на наконечниках для льда в холодильнике. Убедитесь, что все охлажено, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию зрелого геля.

После ресуспензии поместите 50 000 клеток в объеме 50 микролитров в центр верхнего отсека камеры размером 8 микрон. Затем инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы произошла полимеризация. Через 30 минут добавьте 200 микролитров бессывороточной среды в верхнюю камеру и 700 микролитров сыворотки, содержащей среду для роста клеток, в нижнюю лунку.

После инкубации в течение 48 часов извлеките клетки из верхней части камеры с помощью мягкой аспирации. Закрепите камеры, как и раньше, и замените фиксатор на 500 микролитров 1X PBS перед визуализацией клеток.