Изучение трансмиграции лимфоцитов через монослой микрососудистых эндотелиальных клеток

Возьмите микропланшет со вставками transwell, покрытыми белками ECM для стимулирования клеточной адгезии.

Добавьте микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга человека, или HBMEC, во вкладыши и питательную среду в нижние компартменты.

Инкубируют, позволяя клеткам прилипнуть и вырасти в монослой. Эти клетки экспрессируют плотные соединения, имитируя эндотелий гематоэнцефалического барьера, который ограничивает прохождение клеток и молекул.

Удалите среду. Добавьте мононуклеарные клетки периферической крови, или PBMC, во вкладыши и питательную среду в нижние компартменты.

Инкубация, позволяющая лимфоцитам PBMC взаимодействовать с эндотелиальными клетками, а затем проходить между ними, процесс, называемый трансмиграцией.

Промойте дно вкладыша, собирая прилипшие переброшенные клетки в нижние отсеки.

Введите флуоресцентные микрогранулы в качестве эталона для количественного определения клеток.

Перенесите суспензию в пробирку, центрифугу, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в коктейле из фторофор-конъюгированных антител, чтобы пометить лимфоциты.

Трансмигрировавшие лимфоциты готовы к количественному определению с помощью проточной цитометрии.

Чтобы подготовить вкладыши для клеточных культур к анализу трансмиграции, сначала добавьте 100 микролитров раствора фибронектина в каждый вкладыш и в одну лунку 96-луночного планшета с плоским дном. Через три часа при температуре 37 градусов Цельсия замените раствор фибронектина на 100 микролитров HBMEC и добавьте 600 микролитров свежей среды ECM-b в нижние отсеки вставок для клеточных культур.

Затем верните планшеты в инкубатор для клеточных культур на три-четыре дня. Ресуспендируйте образец мононуклеарных клеток периферической крови или PBMC в концентрации от 5 до 6 клеток на миллилитр в среде RPMI с добавлением B27. Затем аспирируют среду из нижнего и верхнего отделов соответствующего числа вкладышей для клеточных культур, содержащих сливающиеся монослои HBMEC, и добавляют 100 микролитров PBMC на каждого донора во вкладыши для клеточных культур и в одну лунку 24-луночного планшета на контроль in vitro.

Добавьте 600 микролитров RPMI плюс B27 в нижние отсеки вкладышей для клеточных культур и 500 микролитров в контрольные лунки in vitro и верните планшеты в инкубатор для клеточных культур на шесть часов. В конце инкубации с помощью щипцов удалите вставки клеточных культур, тщательно промыв донышки 400 микролитрами PBS, не касаясь мембран.

Затем тщательно перемешать 20 микролитров проточных флуоросфер с клетками в экспериментальных и контрольных лунках in vitro и перенести 1 миллилитр полученных суспензий PBMC в соответствующие пробирки проточной цитометрии. Соберите клетки центрифугированием и добавьте интересующие вас конъюгированные антитела флуорохрома в 100 микролитрах буфера для проточной цитометрии в каждый образец. Через 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия промойте клетки 250 микролитрами свежего буфера проточной цитометрии и повторно суспендируйте гранулы в соответствующем объеме буфера проточной цитометрии для анализа.