Оценка трансэндотелиального электрического сопротивления в модели гематоэнцефалического барьера in vitro

Начните с мембранной вставки, содержащей микрососудистые эндотелиальные клетки мозга мыши, напоминающие гематоэнцефалический барьер in vitro.

Поместите эту вставку в лунку трансэндотелиального электрического сопротивления или TEER-прибора, содержащую встроенный электрод.

Добавьте свежий носитель в нижнее отделение.

Поместите крышку с электродами на лунки TEER, затем поместите инструмент в инкубатор и подключите его к записывающей системе.

Электроды генерируют электрический ток через слой ячейки для измерения трансэндотелиального сопротивления.

Интактные соединительные белки между клетками препятствуют протеканию тока, что приводит к более высокому значению TEER.

Отсоедините прибор и снимите его.

Разберите крышку, удалите немного среды из верхнего отсека и добавьте предварительно активированные Т-клетки. Соберите прибор для измерения TEER.

Активированные Т-клетки взаимодействуют с эндотелиальными клетками, высвобождая воспалительные факторы и цитолитические ферменты, нарушая целостность соединения.

Это нарушение увеличивает протекание электрического тока, что приводит к более низкому значению TEER.

Чтобы настроить измерение TEER, поместите 24-луночный модуль прибора TEER в колпак ламинарного потока. Снимите крышки и вставьте вставки с MBMEC в инструмент с помощью щипцов.

Далее пипеткой впрыскиваем 810 микролитров свежей среды в нижний отсек модульных лунок. Аккуратно добавьте его между вставкой и стенкой модуля лункой. После этого закройте крышками и поместите инструмент в инкубатор. Подключите прибор к компьютеру. Затем включите контроллер прибора и откройте программное обеспечение.

Во всплывающем окне выберите «Новое измерение». Отметьте флажками «Показать TEER» и «Показать Ccl», затем нажмите «Начать». После завершения первого измерения выберите «Проверить все скважины» во вкладке «Результаты», чтобы увидеть все значения TEER и Ccl. Затем сохраните файл.

Затем выберите момент времени для совместного культивирования MBMEC с Т-клетками, когда Ccl стабилен и ниже 1 микрофарада на квадратный сантиметр, а TEER достиг своего максимального уровня. Тщательно проверьте абсолютные значения TEER и Ccl и исключите скважины, в которых MBMEC не развили достаточно сливающихся монопластов, сняв с таких скважин отметку.

Сгруппируйте остальные скважины, щелкнув правой кнопкой мыши по скважинам и выбрав «Добавить скважину в новую среднюю скважину». Назовите его во всплывающем окне и сделайте то же самое для всех отдельных скважин, которые нужно сгруппировать. Затем проверьте все средние лунки, чтобы убедиться, что все они имеют одинаковые начальные условия до совместного культивирования.

Во вкладке "Эксперимент" нажмите "Пауза". Отсоедините инструмент и достаньте его из инкубатора. Затем снимите крышки в колпаке с ламинарным потоком. Затем удалите часть среды из вставки в отсеке верхнего колодца. Добавляйте Т-клетки к MBMEC путем тщательного пипетирования 150 микролитров среды. Затем снова подключите прибор и нажмите «Возобновить измерение». Через 24 часа нажмите «Стоп» во вкладке «Эксперимент» и сохраните файл.