Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 2:58 мин. • July 8th, 2025
Возьмите неподвижный участок мозга мыши, содержащий базалис Мейнерта, богатый нервными волокнами, экспрессирующими фермент холинацетилтрансферазу.
Секция предварительно обработана для дезактивации эндогенной пероксидазы.
Добавьте моющее средство для проникновения клеточных мембран, а затем блокирующий раствор для предотвращения связывания неспецифических антител.
Замените раствор первичными антителами, которые связываются с холинацетилтрансферазой.
Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела. Инкубируйте с меченными биотином вторичными антителами, которые связываются с первичными антителами.
Удалите несвязанные антитела и добавьте авидин-биотин-пероксидазные комплексы, которые связываются с вторичными антителами.
Умывайтесь для удаления излишков комплексов.
Добавьте хромогенный субстрат, который вступает в реакцию с пероксидазой, образуя окрашенный осадок.
Смойте дистиллированной водой, чтобы удалить излишки осадка.
Перенесите срез на желатинизированное предметное стекло.
Затем обезвожьте секцию с помощью увеличивающейся концентрации этанола, а затем ксилола.
Установите срез и понаблюдайте под микроскопом, чтобы визуализировать окрашенные нервные волокна.
Для иммуногистохимического мечения участков тканей после блокирования любого неспецифического связывания 10% нормальной бычьей сывороткой в 0,1% Тритоне Х-100 в трис-буферном физрастворе мечают участки с первичным антителом, представляющим интерес, в течение 48 часов при четырех градусах Цельсия.
В конце инкубации промойте срезы три раза, в течение трех минут, в свежем трис-буферном физрастворе на одну промывку. Затем следует инкубация с соответствующим биотинилированным вторичным антителом в течение одного часа при комнатной температуре.
В конце инкубации промойте срезы три раза в свежем трис-буферном физрастворе, как показано на рисунке. Затем следует окрашивание авидин-биотин-пероксидазным комплексом и субстратным раствором DAB-пероксидазы, согласно протоколам производителя.
После промывки закрепите все срезы из одного образца ткани мозга на одном желатинизированном предметном стекле. Дайте образцам высохнуть на воздухе. Для обезвоживания срезов необходимо погрузить образцы два раза, по пять минут на каждое разведение, в последовательные восходящие растворы этанола, как указано, с последующим очисткой двумя 10-минутными промывками ксилола. Затем используйте подходящий монтажный материал, чтобы разместить покровные стекла на предметных стеклах.