Измерение поглощения дофамина в синаптосомах мозга мышей с помощью радиоактивно меченного дофамина

Собирайте синаптосомы, связанные с мембранами структуры, полученные из неповрежденных пресинаптических окончаний нейронных синапсов, которые содержат транспортеры дофамина (DAT), из мозга мыши.

Пробирки заполнить буфером, содержащим лиганды, и пробирки сравнения с буфером, содержащим лиганды и ингибитор DAT.

Добавьте синаптосомы.

Лиганды ингибируют ферменты, разрушающие дофамин, и другие транспортеры, предотвращая деградацию дофамина и неспецифическое поглощение.

Вводите немеченый и радиоактивно меченный дофамин.

В тестовых условиях синаптосомальный DAT поглощает дофамин.

В референсном состоянии ингибитор предотвращает DAT-опосредованное поглощение дофамина, позволяя только фоновое поглощение.

Добавьте образцы в фильтры из микроволокна, которые удерживают синаптосомы.

Промойтесь, чтобы удалить несвязанный дофамин.

Переложите фильтры в сцинтилляционные трубки.

Добавьте сцинтилляционную жидкость, содержащую радиочувствительное соединение.

Поместите трубки в сцинтилляционный счетчик.

Радиоактивные выбросы дофамина возбуждают соединение излучать свет, который измеряется счетчиком.

Вычтите эталон из тестовых данных, чтобы измерить синаптосомальное поглощение дофамина.

На этом этапе добавьте 440 микролитров поглощающего буфера, лиганда и кокаина в 12 специальных 1,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирок и 440 микролитров поглощающего буфера и лиганда в 36 оставшихся 1,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирок. Маркируйте 6 2-миллилитровых микроцентрифужных пробирок как 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 и 0,31. Затем добавьте 750 микролитров абсорбционного буфера и лиганда в 5 микроцентрифужных пробирок с наименьшим числом.

Затем добавьте 1455,4 микролитра буфера поглощения и лиганда, 14,6 микролитра немеченного дофамина и 30 микролитров тритированного дофамина в пробирку с маркировкой 10. Далее переложите 750 микролитров смеси из тюбика с маркировкой 10 в тубу с маркировкой 5. Хорошо перемешиваем, и переливаем 750 микролитров смеси из этой тубы в тубу с маркировкой 2,5. Повторите это разведение с оставшимися трубками.

После этого предварительно промойте стеклянные фильтры из микрофибры 4 миллилитрами всасывающего буфера, поместив их в ведро с фильтром на 12 лунок. После этого добавьте 10 микролитров суспензии синаптосомальной мембраны в первые 24 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки, содержащие 440 микролитров буфера. Осторожно сделайте вихрь и быстро поверните вниз, чтобы убедиться, что синаптосомы погружены в буфер.

Затем оставьте их при температуре 37 градусов по Цельсию на 10 минут. Через 10 минут добавьте в первые 2 колонки 50 микролитров дофамина 10 микромоляров и 5 микромоляров, и оставьте их при температуре 37 градусов Цельсия на 5 минут с встряхиванием. Через 5 минут остановите реакцию, добавив 1 миллилитр ледяного буфера для поглощения. Повторите это с 2,5 микромолярами и 1,25 микромолярами, а затем с 0,62 микромолярами и 0,31 микромолярами.

Добавьте образцы в предварительно промытые фильтры из микрофибры и промойте их 5 x 4 миллилитров ледяного буфера. После того, как первые 12 образцов будут добавлены в фильтры, переместите фильтры в сцинтилляционные трубки. Повторите то же самое со следующими 12 образцами. Подготовьте 3 максимальные счетные трубки, поместив фильтр из микрофибры на дно сцинтилляционных пробирок с 49 по 51, и добавив сверху 25 микролитров максимального дофамина 10 микромоляров.

После этого оставьте все 51 сцинтилляционную трубку в вытяжном шкафу на 1 час. Затем добавьте по 3 миллилитра сцинтилляционной жидкости в каждую сцинтилляционную пробирку и энергично встряхивайте на шейкере в течение 1 часа. Чтобы посчитать тритиированный дофамин в бета-счетчике за 1 минуту, откройте программу и выберите подходящие настройки. Для определения белка используйте стандартный набор для анализа белка BCA, чтобы определить концентрацию белка в синаптосомах, для корректировки и для правильного сравнения поглощения между образцами.