Гибридизация in situ с использованием олигонуклеотидных зондов для изучения экспрессии РНК в срезах мозга крыс

Возьмите фиксированные участки мозга у крысы с серотониновым синдромом, который приводит к изменению синтеза РНК серотониновых рецепторов в нейронах.

Обезвоживайте ткани с помощью спирта. Применяют раствор предварительной обработки для дезактивации эндогенных гидролизующих ферментов, препятствуя их взаимодействию с реагентами детектирования.

Обработайте кипящим буфером, чтобы разорвать сшивки, вызванные фиксацией, обнажая целевые РНК.

Обезвоживайте ткань, рисуйте гидрофобный барьер и инкубируйте ее с раствором для проникновения клеточных мембран.

Добавьте олигонуклеотидные зонды и инкубируйте, позволяя зондам гибридизоваться с целевыми РНК.

Промойте, чтобы удалить несвязанные зонды, затем инкубируйте с реагентами амплификации, содержащими предусилитель, усилитель и конъюгированные с ферментом зонды-метки, которые связываются с олигонуклеотидными зондами.

Инкубируйте с хромогенными субстратами, которые гидролизуются фермент-конъюгированными зондами, производя видимый цвет.

Обработайте ксилолом для повышения прозрачности тканей, добавьте монтажную среду и наклейте покровное стекло.

Под микроскопом цветные пятна в ткани помогают количественно оценить экспрессию целевой РНК.

В эту процедуру для обезвоживания берут четыре предметных стекла для микроскопа, хранящиеся в морозильной камере с отрицательным температурой 80 градусов Цельсия. Назначьте срезы для тестов генов ppiB, dapB и ht2a. Отметьте и обозначьте их шариковой ручкой.

Далее погрузите горки в 100% спирт комнатной температуры на пять минут. Затем просушите слайды в течение пяти минут в вытяжном шкафу. Для предварительной обработки пипеткой следует дозировать по 20 микролитров предварительно обработанного реактива по одному реактиву на каждую секцию.

Поместите слайды на решетку в поддон для влаги. Аккуратно встряхните лоток с влагой на горизонтальном встряхивателе на низкой скорости в течение 10 минут. Затем дважды промойте предметные стекла двойной дистиллированной водой в течение двух минут. Погрузите предметные стекла в стакан объемом 1000 миллилитров, содержащий 450 миллилитров реагента для предварительной обработки 2.

Затем прокипятите предметные стекла в общей сложности пять минут при температуре 100 градусов Цельсия, чтобы восстановить структуру РНК. После этого каждый раз дважды промойте предметные стекла дважды дистиллированной водой в течение двух минут. Поместите предметные стекла в 100% спирт на пять минут.

Затем просушите горки в течение пяти минут в вытяжном шкафу. С помощью гидрофобной ручки нарисуйте круг вокруг выделенной области на участке ткани. Впоследствии пипеткой нанесите 10 микролитров реактива для предварительной обработки на каждую выбранную область для увеличения проникновения зонда и накройте лоток для влаги крышкой.

Далее поместите противень в печь для гибридизации, оснащенную горизонтальным встряхивателем. Установите температуру духовки на 40 градусов по Цельсию и аккуратно встряхивайте противень в течение 30 минут. После этого дважды промойте предметные стекла двойной дистиллированной водой в течение двух минут каждый раз.

На этом этапе пипетируйте 10 микролитров зонда ppiB, dapB или htr2a на выбранные участки. Затем накройте лоток для влаги крышкой, чтобы предотвратить испарение реагента. Аккуратно встряхивайте слайды на горизонтальном шейкере на низкой скорости, выдерживая их при температуре 40 градусов Цельсия в духовке в течение двух часов.

Далее каждый раз дважды промойте предметные стекла с буфером для стирки по две минуты. Пипеткой по 10 мкл амплификации 1 реактива на каждый выбранный участок. Встряхните и выдержите предметные стекла при температуре 40 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем каждый раз дважды промойте предметные стекла с буфером для стирки в течение двух минут.

Пипеткой по 10 микролитров амплификатора 2 на каждую выбранную область. Встряхните и выдержите предметные стекла при температуре 40 градусов Цельсия в течение 15 минут. После этого каждый раз дважды промойте предметные стекла буфером для промывки в течение двух минут.

Пипеткой нанесите 10 микролитров амплификатора 3 на каждый выбранный участок. Встряхните и выдержите предметные стекла при температуре 40 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение двух минут.

Пипеткой нанесите по 10 микролитров амплификатора 4 на каждый выбранный участок. Встряхните и выдержите предметные стекла при температуре 40 градусов Цельсия в течение 15 минут. Далее дважды промойте слайды с буфером для промывки в течение двух минут.

Пипеткой по 10 микролитров амплификатора 5 нанесите на каждую выбранную область. Встряхните и выдержите горки при комнатной температуре в течение 30 минут. Впоследствии дважды промойте горки с буфером для промывки в течение двух минут.

Пипеткой нанесите 10 микролитров амплификатора 6 на каждый выбранный участок. Встряхните и выдержите предметные стекла при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем снова дважды промойте предметные стекла с буфером для промывки в течение двух минут каждый раз.

Теперь нанесите пипеткой по 10 микролитров красного реактива на каждую выбранную область. Поместите слайды в поддон для влаги на горизонтальный шейкер при комнатной температуре и осторожно встряхивайте на низкой скорости в течение 10 минут. Затем дважды промойте предметные стекла двойной дистиллированной водой в течение 10 минут каждый раз.

Сушите горки при температуре 60 градусов Цельсия в духовке в течение 15 минут. После этого поместите предметные стекла в ксилол в вытяжной шкаф на пять минут. Далее нанесите пипеткой 20 микролитров монтажного носителя на основе ксилола на каждый выбранный участок и накройте покровным колпачком.