JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:26 мин • July 8th, 2025
Начнем с мозга трансгенных мух дрозофилы, содержащих различные типы глиальных клеток, несущих клеточно-специфическую систему рекомбиназы.
Он управляет экспрессией белка клеточной поверхности, слитого с различными антигенными эпитопами на клетках одного типа.
Обработайте ткань фиксатором для сшивания белков и сохранения архитектуры ткани.
Вымойте для удаления излишков фиксатора.
Добавьте блокирующие белки для маскировки неспецифических сайтов связывания, чтобы уменьшить фоновое окрашивание.
Инкубируйте ткань с помощью первичного коктейля антител, который связывается с различными эпитопами, экспрессируемыми на глиальных клетках.
Промойте, чтобы удалить несвязанные первичные антитела.
Инкубируйте с флуорофор-конъюгированными вторичными антителами, которые связываются с первичными антителами.
Промойте, чтобы удалить несвязанные вторичные антитела.
Установите мозг внутрь спейсера для визуализации и установите покровную крышку. Спейсер создает камеру для ткани, сохраняя ее трехмерную структуру.
Различные клетки одного и того же глиального типа, меченные различными флуорофор-конъюгированными антителами, позволяют понять межклеточные взаимодействия.
Перенесите изолированный мозг с помощью наконечника для пипетки P10 в микроцентрифужную пробирку объемом 200 микролитров с фиксирующим раствором. Никогда не обрабатывайте мозг с помощью щипцов. Инкубируйте ткани, защищенные от света. Избегайте аспирации мозга во время переноса раствора.
Чтобы снять фиксатор, используйте три или более 15-минутных промывки с моющим раствором. Затем заблокируйте ткани блокирующим раствором на 30 минут или дольше. Далее замените блокирующий раствор первичными антителами, разведенными в растворе для промывки, и инкубируйте мозги в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.
Для удаления первичных антител используйте три 1-часовых промывки в растворе для промывки. Далее добавьте вторичные флюорофорные конъюгированные антитела в раствор для промывки и инкубируйте мозги в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия, или в течение 4 часов при комнатной температуре. Чтобы полностью смыть несвязанные антитела, используйте три 1-часовых промывки в растворе для промывки, за которыми следует более длительное промывание PBS.
Затем смонтируйте мозги. Подготовьте два покровных стекла с помощью распорки для изображения. В распорку и на дополнительное покровное стекло нанесите 10 микролитров монтажной среды с антивыцветающим средством. Затем с помощью пипетки P10 перенесите мозги на покровную крышку, поместив их рядом со средой вместе с небольшим количеством PBS. Не допускайте пересыхания тканей.
Теперь осторожно переместите мозги в монтажную среду с помощью пипетки. И, наконец, переместите их в среду в спейсере и расположите щипцами. Затем снимите клейкую подкладку с распорок и прикрепите покровное стекло. Зафиксируйте покровное стекло с небольшим нажимом с помощью щипцов и немедленно приступайте к визуализации.
В данной статье подробно описывается протокол визуализации глиальных клеток в головном мозге трансгенных Drosophila с использованием методов иммунофлуоресценции. В методе подчеркивается важность сохранения архитектуры ткани и минимизации фонового окрашивания для точной визуализации взаимодействий клеток.
Иммунофлуоресцентное окрашивание мозга Drosophila с высоким разрешением позволяет проводить точную визуализацию отдельных клеток глиальных субпопуляций, что способствует снижению рисков при изучении механизмов на ранних этапах нейробиологических исследований. Данный подход повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней, обеспечивая возможность прямой визуализации межклеточных взаимодействий и экспрессии маркеров, специфичных для конкретных субпопуляций. Метод предназначен для принятия решений по формированию портфеля исследований в случаях, когда биология глии лежит в основе путей, связанных с заболеванием.
Данный протокол иммунофлуоресценции интегрируется в этапы раннего поиска и валидации мишеней, обеспечивая переход к доклинической визуализации и фенотипическому скринингу в случаях, когда задействована биология глии.
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026