Иммунофлуоресцентное окрашивание мозга дрозофилы для визуализации глиальных клеток на отдельных клетках

Начнем с мозга трансгенных мух дрозофилы, содержащих различные типы глиальных клеток, несущих клеточно-специфическую систему рекомбиназы.

Он управляет экспрессией белка клеточной поверхности, слитого с различными антигенными эпитопами на клетках одного типа.

Обработайте ткань фиксатором для сшивания белков и сохранения архитектуры ткани.

Вымойте для удаления излишков фиксатора.

Добавьте блокирующие белки для маскировки неспецифических сайтов связывания, чтобы уменьшить фоновое окрашивание.

Инкубируйте ткань с помощью первичного коктейля антител, который связывается с различными эпитопами, экспрессируемыми на глиальных клетках.

Промойте, чтобы удалить несвязанные первичные антитела.

Инкубируйте с флуорофор-конъюгированными вторичными антителами, которые связываются с первичными антителами.

Промойте, чтобы удалить несвязанные вторичные антитела.

Установите мозг внутрь спейсера для визуализации и установите покровную крышку. Спейсер создает камеру для ткани, сохраняя ее трехмерную структуру.

Различные клетки одного и того же глиального типа, меченные различными флуорофор-конъюгированными антителами, позволяют понять межклеточные взаимодействия.

Перенесите изолированный мозг с помощью наконечника для пипетки P10 в микроцентрифужную пробирку объемом 200 микролитров с фиксирующим раствором. Никогда не обрабатывайте мозг с помощью щипцов. Инкубируйте ткани, защищенные от света. Избегайте аспирации мозга во время переноса раствора.

Чтобы снять фиксатор, используйте три или более 15-минутных промывки с моющим раствором. Затем заблокируйте ткани блокирующим раствором на 30 минут или дольше. Далее замените блокирующий раствор первичными антителами, разведенными в растворе для промывки, и инкубируйте мозги в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

Для удаления первичных антител используйте три 1-часовых промывки в растворе для промывки. Далее добавьте вторичные флюорофорные конъюгированные антитела в раствор для промывки и инкубируйте мозги в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия, или в течение 4 часов при комнатной температуре. Чтобы полностью смыть несвязанные антитела, используйте три 1-часовых промывки в растворе для промывки, за которыми следует более длительное промывание PBS.

Затем смонтируйте мозги. Подготовьте два покровных стекла с помощью распорки для изображения. В распорку и на дополнительное покровное стекло нанесите 10 микролитров монтажной среды с антивыцветающим средством. Затем с помощью пипетки P10 перенесите мозги на покровную крышку, поместив их рядом со средой вместе с небольшим количеством PBS. Не допускайте пересыхания тканей.

Теперь осторожно переместите мозги в монтажную среду с помощью пипетки. И, наконец, переместите их в среду в спейсере и расположите щипцами. Затем снимите клейкую подкладку с распорок и прикрепите покровное стекло. Зафиксируйте покровное стекло с небольшим нажимом с помощью щипцов и немедленно приступайте к визуализации.