Флуоресцентное окрашивание клеток нервного гребня, культивируемых на гидрогелях различной жесткости

Берут адгезивные культуры клеток нервного гребня, выращенные на покровных листах, покрытых гидрогелями различной жесткости. Промойте ячейки буфером.

Добавьте параформальдегид для фиксации клеток и сохранения клеточной морфологии.

Промойте клетки буфером, чтобы удалить излишки параформальдегида.

Затем добавьте неионогенное моющее средство для проникновения в клеточные мембраны.

Промойте ячейки с буфером, чтобы удалить излишки моющего средства.

Затем введите решение для блокировки для предотвращения неспецифической привязки.

Инкубируйте клетки с помощью высокоаффинного филаментного актинового зонда, который связывается с актиновыми филаментами.

Промойте ячейки буфером, чтобы удалить все непривязанные щупы.

Добавьте флуоресцентный ядерный краситель, чтобы окрасить ядра, затем промойте буфером, чтобы удалить излишки красителя.

Нанесите монтажный материал на покровные стекла и осмотрите окрашенные клетки под флуоресцентным микроскопом.

Клетки, выращенные на более жестких гидрогелях, демонстрируют повышенное образование актиновых филаментов и более распространенную морфологию, чем клетки, выращенные на более мягких гидрогелях.

Используйте пинцет для транспортировки покровных стекол на новую пластину, чтобы свести к минимуму ложные сигналы от клеток, выращенных непосредственно на пластине. Затем зафиксируйте клетки с помощью 500 микролитров 4% параформальдегида в течение 10 минут, перед этим обработайте клетки 500 микролитрами 0,1% Triton X-100 при комнатной температуре.

Через 15 минут заблокируйте клетки 250 микролитрами 10% сыворотки осла. Окрашивают клетки на F-актин фаллоидином в разведении от 1 до 400 в 250 мкл 10% ослиной сыворотки с последующей инкубацией с DAPI в течение 10 минут.

Промойте ячейки PBS в течение двух минут, прежде чем добавить три-четыре капли монтажной среды в каждую лунку. На флуоресцентном микроскопе можно получить изображения не менее трех случайных кадров для каждого образца гидрогеля, создавая отдельные и объединенные каналы.