Оценка поглощения глюкозы в моторных нейронах личинок дрозофил с повышенным метаболизмом глюкозы

Поместите контрольные и мутантные личинки дрозофилы в отдельные чашки, содержащие буфер, не содержащий глюкозы.

Препарируйте личинок для удаления внутренних органов, обнажая центральную нервную систему или ЦНС.

ЦНС включает в себя вентральный нервный канатик, в котором находятся двигательные нейроны. У мутантных личинок эти нейроны демонстрируют повышенную регуляцию метаболизма глюкозы.

Моторные нейроны в обеих группах экспрессируют внутриклеточные рецепторы глюкозы, содержащие донорные и акцепторные флуорофоры.

Расположите личинок под конфокальным микроскопом. При возбуждении донорский флуорофор испускает флуоресценцию.

Определите местоположение моторных нейронов с помощью этой флуоресценции.

Замените буфер раствором с добавлением глюкозы.

Глюкоза проникает в нейроны, связываясь с сенсорами и вызывая конформационные изменения, которые делают два флуорофора близкими.

При возбуждении акцептор поглощает излучаемую донором энергию, называемую флуоресцентным резонансным переносом энергии или FRET, и излучает флуоресценцию.

Сигнал FRET коррелирует с поглощением глюкозы. Более высокая интенсивность акцепторного сигнала у мутантных личинок по сравнению с контролем указывает на повышенную регуляцию метаболизма глюкозы.

Перед началом вскрытия включите микроскоп и лазеры. Затем соберите блуждающую личинку третьего возраста. Промойте его водой двойной дистилляции и поместите в каплю буфера HL3 на заранее подготовленную посуду, выстланную эластомером.

Затем под рассекающим микроскопом с помощью пары щипцов приколите передний и задний концы личинки тыльной стороной вверх, осторожно растягивая личинку вдоль булавками от насекомых. С помощью наклонных ножниц для радужной оболочки сделайте надрез чуть выше заднего штифта. Затем сделайте вертикальный надрез от разреза по направлению к переднему концу личинки.

После добавления нескольких капель буфера HL3, при необходимости, удалите трахею и остальные плавающие органы, не нарушая центральную нервную систему. Затем приколите створки, растягивая стенки тела, чтобы обнажить центральную нервную систему, сохраняя при этом нервно-мышечную систему в целости.

Для получения изображений используйте вертикальный конфокальный микроскоп с 40-кратным водяным иммерсионным объективом. Затем выберите 405-нанометровый лазер для возбуждения CFP. Затем оптимизируйте параметры сбора данных, такие как скорость сканирования, среднее значение, объектив, размер отверстия зума и пространственное разрешение. Отрегулируйте усиление таким образом, чтобы сигнал находился в оптимальном динамическом диапазоне, и используйте одни и те же параметры для всех генотипов.

Чтобы визуализировать двигательные нейроны в вентральном нервном канатике, поместите силиконовую чашку с расчлененным образцом под хрусталик и опустите хрусталик так, чтобы он соприкасался с трегалозой сахарозы HL3. Убедитесь, что объектив полностью погружен в буфер, и при необходимости добавьте еще буфер.

Далее с помощью каналов CFP и FRET вручную выбрать оптическую выборку, состоящую не менее чем из 6 моторных нейронов в фокусе, расположенных вдоль средней линии вентрального нервного канатика. Затем получайте изображения каждые 10 секунд или 10 минут. Эти изображения представляют собой базовую линию.

Для стимуляции глюкозы удалите трегалозу, содержащую буфер HL3, с помощью пипетки Пастера и добавьте 5 миллимолярных буферов HL3, дополненный глюкозой, не перемещая вентральный нервный канатик. Затем получайте изображения каждые 10 секунд в течение еще 10 минут.

Эти изображения представляют фазу стимуляции. Сохраните изображения в виде файлов dot czi или любого типа файла, поддерживаемого программным обеспечением для обработки изображений, с именем файла, включающим дату, генетический фон, экспериментальное состояние и используемые каналы. Повторно использовали параметры для визуализации всех генотипов.