$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Возьмем неподвижный срез ткани мозга мыши, содержащий разреженную популяцию астроцитов, экспрессирующих флуоресцентный белок.
Обработайте свободно плавающий участок буфером, содержащим моющее средство, чтобы проникнуть в клетки.
Инкубируйте секцию в блокирующем буфере, чтобы предотвратить связывание неспецифических антител.
Обработайте срез первичными антителами и инкубируйте, чтобы антитела могли связываться с флуоресцентными белками в астроцитах.
Смойте избыток первичных антител с помощью буфера.
Затем инкубируйте секцию с меченными флуорофорами вторичными антителами, которые связываются с первичными антителами.
Смойте несвязанные вторичные антитела буфером.
Переведите секцию в буферно-деионизированную водную смесь для удаления остатков моющего средства.
Поместите секцию на предметное стекло с буферно-деионизированной водой. Удалите лишнюю жидкость и добавьте монтажный материал. Затем установите покровную крышку и закрепите ее.
Наконец, используйте конфокальную микроскопию для визуализации меченых флуоресцентных астроцитов, экспрессирующих белки, в пределах разреза.
Для начала приготовьте свежий раствор TBST, добавив 1 миллилитр 10% Triton X в 50-миллилитровую тубу и заполнив пробирку до 50 миллилитров TBS. Приготовьте по 2 миллилитра растворов блокирующих и антител для каждого мозга, соединив козью сыворотку и TBST в 15-миллилитровой тубе.
Затем пометьте 24-луночный планшет, чтобы разместить разные образцы в разных рядах, в разных растворах, в разных столбцах. Затем добавьте 1 миллилитр TBST в первые три колонки, помеченные как «Wash 1», «Wash 2» и «Wash 3», и добавьте 1 миллилитр блокирующего раствора в четвертую колонку.
Приготовьте медиатор для стекла, расплавив конец 5,75-дюймовой пипетки Пастера в маленький крючок с помощью горелки Бунзена. Затем перенесите срезы ткани из 12-луночного планшета в столбец «Промывка 1» 24-луночного планшета с помощью медиатора. Затем промойте срезы в течение 10 минут каждый в 1, 2 и 3 лунках, перенося срезы из одной лунки в другую, с помощью медиатора для переноса срезов из одной лунки в другую, а затем инкубируйте срезы в течение одного часа в растворе для блокировки.
Затем инкубируйте срезы первичных антител в течение двух-трех ночей при температуре 4 градуса Цельсия во время встряхивания. После первичной инкубации антител аспирируйте в первый день TBST из промывочных лунок. Затем добавьте 1 миллилитр нового TBST в каждую лунку для стирки и переместите секции в первую лунку для стирки.
Далее инкубируйте срезы во вторичном антителе в течение трех часов при комнатной температуре. После вторичной инкубации антител отсасывайте на второй день TBST из промывочных лунок. Затем добавьте 1 миллилитр нового TBST в каждую лунку для стирки и переместите секции в первую лунку для стирки.
Во время окончательной промывки извлеките монтажный материал из температуры от 4 градусов Цельсия и дайте ему нагреться до комнатной температуры. Затем приготовьте смесь TBS в соотношении 2 к 1 в деионизированной воде и добавьте ее в чашку Петри. Далее приготовьте предметное стекло микроскопа, добавив на поверхность 800 микролитров смеси 2 к 1 TBS в деионизированной воде.
Переложите срезы из лунки «Wash 3» в чашку Петри. Затем с помощью тонкой кисти переложите секции по одному из чашки Петри в жидкость на предметном стекле. Далее аккуратно расположите секции так, чтобы они были ровно на предметном стекле с помощью кисти. Осторожно удалите лишнюю жидкость с предметного стекла с помощью пипетки P1000 с последующей вакуумной аспирацией.
После того, как вся лишняя жидкость будет удалена с предметного стекла, с помощью переводной пипетки немедленно добавьте по одной капле монтажного материала в каждую секцию и аккуратно наложите покровное стекло на предметное стекло. Дайте монтажному материалу распределиться в течение нескольких минут, а затем удалите излишки монтажного материала, выходящие из-под защитного стекла, с помощью вакуумной аспирации. После этого заклейте все четыре края покровного стекла прозрачным лаком для ногтей.