Лазерная микродиссекция для выделения клеток Пуркинье из посмертной ткани мозжечка человека

Возьмем посмертную ткань мозжечка человека, содержащую клетку Пуркинье, гранулы и молекулярные клеточные слои.

Поместите его на держатель для образцов криостата, содержащий частично замороженную среду для встраивания.

Дайте носителю полностью замерзнуть, закрепив ткань.

Перенесите эту сборку в режущую руку криостата и дайте ткани акклиматизироваться до температуры криостата.

Переместите ткань ближе к лезвию и обрежьте ее, чтобы обнажить слои коры головного мозга.

Поместите пластину против крена над лезвием и получите участки мозжечка.

Перенесите эти срезы на предметное стекло

Инкубируйте с возрастающей концентрацией этанола для фиксации тканей и обезвоживания.

Затем инкубируйте в ксилоле.

Высушите предметное стекло и поместите его на предметный столик для микроскопа с УФ-лазером.

Расположите колпачок для сбора над мозжечковой тканью.

Под микроскопом сосредоточьтесь на клетках Пуркинье.

С помощью лазера захватывают и собирают клетки Пуркинье для дальнейшего анализа.

Сначала отрежьте небольшой кусочек ткани для разреза, убедившись, что срез примерно на 95% состоит из коры мозжечка. Остатки салфеток верните либо в сухой лед, либо в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Затем начните медленно добавлять ОКТ на верхнюю часть патрона медленными круговыми движениями. Наращивайте слои ОКТ до тех пор, пока не образуется холмик высотой примерно три миллиметра, покрывающий патрон.

Когда ОКТ частично замерзнет, но в центре все еще будет немного жидкости, поместите ткани поверх холмика. Оставьте ткани на верхней части ОКТ на 1-2 минуты, пока он полностью не замерзнет. Затем перенесите патрон с замороженным ОКТ и тканью в режущий кронштейн криостата. Отрегулируйте ткань так, чтобы она была на одном уровне с режущим лезвием, и оставьте салфетки в режущем рычаге на 20 минут, чтобы они привыкли к новой температуре.

Наиболее важным этапом является предоставление ткани возможности акклиматизироваться в режущей руке криостата столько, сколько необходимо. Если ткани разорваны, визуализация клеток Пуркинье будет очень затруднительной. Я рекомендую использовать более мелкие и тонкие кусочки ткани, чтобы позволить ткани быстрее акклиматизироваться.

После этого медленно перемещайте ткань ближе к лезвию. Как только ткань достигнет лезвия, приступайте к процессу обрезки. Обрежьте ткань от 2 до 3 раз, пока не станут видны слои коры головного мозга.

Затем поместите и выровняйте пластину для предотвращения крена чуть выше лезвия криостата. Отрежьте от 4 до 6 секций толщиной 14 микрометров, обращая внимание на то, что правильно разрезанные секции будут плоскими под пластиной антикрена. Выровняйте срезанные участки горизонтально по всей стадии криостата.

Наклоните предметное стекло, чтобы захватить все кусочки салфетки одновременно. Сразу после разрезания ткани поместите предметное стекло в держатель предметного стекла с 70% этанолом на лед на 2 минуты. Перенесите предметное стекло в держатель предметного стекла с 95% этанолом на лед на 45 секунд.

Далее поместите предметное стекло в держатель слайдов со 100% этанолом при комнатной температуре на 2 минуты. Опустите предметное стекло 3 раза в держатель предметного стекла, содержащий ксилол No 1 при комнатной температуре. Затем поместите предметное стекло в держатель слайдов с ксилолом 2 при комнатной температуре на 5 минут. Поставьте слайды в чистый вытяжной шкаф и дайте им высохнуть на воздухе не менее 30 минут.

Во-первых, используйте обеззараженную РНКазу для очистки предметного столика микроскопа в рукаве для сбора крышек. В руках в перчатках поместите предметное стекло на микроскоп и непрозрачный колпачок объемом 500 микролитров в кронштейн для сбора. При малом увеличении совместите непрозрачный колпачок над мозжечковой тканью, следя за тем, чтобы колпачок охватывал всю область, которая визуализируется в окуляре.

Используйте объектив от 5 до 10 раз, чтобы визуализировать слои мозжечка. Наведите курсор на участок, где пересекаются молекулярный слой и слой гранулярных клеток. Перейдите к 40-кратному увеличению и визуализируйте клетки Пуркинье. Затем начните их снимать.