Обработка мозга мыши для последующего анализа

Возьмите свежесобранный мозг мыши и заморозьте его в предварительно охлажденном изопентане для быстрой сохранности тканей.

Затем перенесите мозг корой вверх в замороженную мозговую матрицу, чтобы поддерживать холодную среду во время нарезки.

Позвольте мозгу уравновеситься до температуры матрицы. Выровняйте его в матрице по сагиттальной и поперечной пазухам, чтобы обеспечить симметричность сечений.

Вставьте охлажденные лопасти в мозг, обеспечив правильное выравнивание.

Затем равномерно прижмите их, чтобы получить однородные участки мозга.

Снимите лезвия с секциями и расположите их ростральной стороной вверх на пластине из замороженного стекла.

Организуйте секции от ростральной до каудальной ориентации в правильном анатомическом порядке. Теперь разделите их.

Используя подходящий референс для мозга, найдите и вырежьте интересующую область из разреза.

Переложите иссеченную ткань в предварительно охлажденный флакон для последующего анализа.

После удаления мозга у усыпленных взрослых мышей дикого типа CD-1 флэш замораживают ткань на 60 секунд в жидком азоте или изопентане, предварительно охлажденном сухим льдом, и хранят ее при температуре -80 градусов Цельсия.

За 24 часа до вскрытия ткани поместите чистую мозговую матрицу на стопку размороженных пакетов из морозильной камеры и зажмите боковые стороны матрицы между двумя пакетами для заморозки, убедившись, что между нижней частью прорезей бритвы и верхней частью пакетов остается примерно полсантиметра.

Установите замороженную стеклянную пластину для вскрытия, заполнив изолированный ящик льдом примерно до 5 сантиметров сверху. Затем положите сверху слой сухого льда толщиной 2,5 сантиметра и накройте его черной пластиковой пленкой. Поместите стеклянную тарелку поверх пластика и сухой лед по краям тарелки.

Извлеките замороженную матрицу мозга из морозильной камеры и вставьте в нее корой головного мозга стороной вверх. Дайте салфетке сбалансироваться до температуры в коробке в течение 10 минут, держа крышку открытой в течение этого времени. С помощью холодных щипцов отрегулируйте положение мозга в матрице так, чтобы сагиттальный синус и поперечный синус совпадали с перпендикулярными бороздками блока.

Как только мозг будет в нужном положении, поместите охлажденное лезвие бритвы рядом с его центром и вдавите его примерно на 1 миллиметр в ткань. Затем поместите по одному охлажденному лезвию на каждый конец мозга и надавите на матрицу до упора. Затем начните добавлять охлажденные лопасти на ростральном конце, помещая их в пазы по одному и аккуратно вдавливая их на 1 миллиметр в ткань. Продолжайте добавлять лопасти с интервалом в 1 миллиметр, двигаясь к хвостовому концу.

Когда все лезвия будут на своих местах, надавите сверху пальцами, ладонью или тупым предметом и медленно покачивайте их из стороны в сторону, чтобы провести ими по тканям. Как только лопасти достигнут дна пазов, возьмитесь за каждую сторону группы лопастей и освободите их от матрицы, покачиваясь вперед и назад.

Освободив группу лопастей, поместите их ростральной стороной вверх на стеклянную пластину и положите сухой лед рядом или сверху стопки, чтобы еще больше заморозить образцы для более легкого разделения. Затем поместите стопку острыми краями вниз и разделите лезвия, переложив стопку между большим пальцем и пальцами.

Выровняйте срез на стеклянных пластинах от рострального к каудальному, и отделите ткань от лопастей, согнув их между пальцами или разделив их с помощью второго охлажденного лезвия. Иногда ткань может прилипать к обеим сторонам лезвия, и необходимо соблюдать осторожность для сохранения ростральной ориентации к каудальной.

Прежде чем начать вскрытие, откройте Атлас мозга мыши Аллена или другой справочник и найдите ориентиры, необходимые для определения областей интереса. Используйте охлаждаемые щипцы или лезвия, чтобы перевернуть секцию, и убедитесь, что область интереса одинакова по всему сечению.

Разрежьте срез чистым скальпелем или перфоратором, мягко, но сильно вдавливая металл в ткань, раскачивая его вперед и назад, чтобы сделать разрез. После сбора урожая поместите его в маркированные предварительно охлажденные 1,5-миллилитровые пробирки и храните их при температуре -80 градусов по Цельсию.