JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:55 мин • July 8th, 2025
Разморозьте участок замороженной ткани мозга крысы.
Добавьте буфер и пропустите через мясорубку. Затем переложите его в пробирку с буфером и перемешайте.
Центрифугируйте смесь и выбросьте надосадочную жидкость.
Добавьте в ткань раствор протеолитического фермента и ресуспендируйте его с помощью пипетки большого диаметра.
Инкубируйте смесь, чтобы разрушить внеклеточный матрикс, разрыхлив нервные клетки.
Центрифугируйте смесь и выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте фрагменты ткани в охлажденном буфере и многократно пипетируйте их, чтобы диссоциировать клетки.
Дайте мусору и недиссоциированным клеткам осесть, затем перенесите одноклеточную суспензию в новую трубку.
Переведите ячейки в ледяной этанол и перемешайте. Инкубируйте их, чтобы закрепить и пропитать клетки.
Центрифугируйте суспензию и выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте нервные клетки в холодном буфере для дальнейшего анализа.
Чтобы измельчить ткань, дайте образцам оттаять на холодной стеклянной пластине не более чем на 1 минуту, прежде чем покрыть образцы одной-двумя каплями буферного раствора А. Далее, держа лезвие бритвы полностью вертикально к пластине, измельчите ткань по 100 раз в каждом ортогональном направлении. Чтобы тщательно измельчить ткань, крайне важно поддерживать ткань влажной с помощью буфера А и следовать указанному времени и указанию измельчения.
Крайне важно удалить большую часть белого вещества во время рассечения тканей и сохранить ткань, покрытую буфером А, для повышения эффективности измельчения и поддержания здоровья клеток.
Когда ткань будет тщательно обработана, используйте лезвие бритвы, чтобы перенести кусочки в микроцентрифужную трубку, содержащую 1 миллилитр холодного буфера А, и переверните трубку от трех до пяти раз, чтобы погрузить всю измельченную ткань в раствор. Чтобы диссоциировать фрагменты ткани в единую клеточную суспензию, гранулируйте образцы методом центрифугирования.
Выбросьте надосадочную жидкость, затем медленно добавьте 1 миллилитр холодного, только что размороженного ферментного раствора вниз по внутренней стенке микротрубки и с помощью пипетки большого диаметра наконечника немедленно аспирируйте и дозируйте всю каждую гранулу четыре раза, чтобы рассеять кусочки измельченной ткани. Затем быстро переверните микротрубку, чтобы гранулы не прилипли к дну пробирки, и инкубируйте образец с перемешиванием из конца в конец в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия.
По окончании разложения снова центрифугируйте пробирку и добавьте в клетки 0,6 миллилитра холодного буфера А. Используя тот же наконечник пипетки, немедленно отасуньте и дозируйте гранулы пять раз, затем выберите стеклянную пипетку диаметром 1,3 миллиметра и используйте ее для осторожного титрования образцов 10 раз.
Поместите образец на лед на 2 минуты, чтобы обломки и недиссоциированные клетки осели на дно пробирки. Затем переложите надосадочную жидкость в новую 15-миллилитровую трубку. Затем перенесите 800 микролитров клеток из первой пробирки собранной надосадочной жидкости в каждую из первых двух пробирок с этанолом.
Переверните пробирки, чтобы перемешать образцы. Затем поместите образцы на лед на 15 минут с перемешиванием методом инверсии каждые 5 минут. По окончании инкубации центрифугируйте клетки. Затем, касаясь только стенки микротрубки, с помощью микропипетки медленно удалите все, кроме последних 50 микролитров каждой надосадочной жидкости.