Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 3:08 мин. • July 8th, 2025
Возьмем стенку тела личинки дрозофилы, состоящую из мышц, иннервируемых двигательными нейронами для формирования нервно-мышечных соединений или NMJ.
Постсинаптическая мышечная мембрана в NMJ содержит взаимодействующие мембраносвязанные белки, которые помечены первичными антителами.
Добавьте анализ бесконтактного лигирования, или PLA, зонды, содержащие вторичные антитела, конъюгированные с одноцепочечными олигонуклеотидами. Инкубируйте зонды, чтобы они связались с первичными антителами.
Смойте все незакрепленные щупы.
Инкубировать с буфером для лигирования, содержащим соединительные олигонуклеотиды и ферменты лигазы.
Близость взаимодействующих белков облегчает связывание соединителя с зондами. Затем лигаза запечатывает пробелы, создавая кольцевую ДНК.
Смойте все незавязанные разъемы.
Инкубируйте с раствором для амплификации, содержащим полимеразу, которая амплифицирует кольцевую ДНК за счет амплификации по вращающемуся кругу.
Меченные флуорофорами детекторные зонды в растворе отжигают амплифицированную ДНК и при возбуждении производят флуоресцентный сигнал.
Установите стенку тела на предметное стекло, чтобы визуализировать флуоресцентно меченые белок-белковые взаимодействия в NMJ.
Чтобы начать анализ, добавьте от 1 до 5 разведения не менее чем на 200 микролитров в общем объеме как зонда PLA anti-mouse minus, так и зонда PLA antirabbit plus в 1% BSA к стенкам тела. Выдерживать в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия.
После использования буфера для промывки стенок тела два раза по 5 минут каждый, добавьте от 1 до 40 разведение лигазы в растворе лигазы. Выдерживать в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия.
После инкубации используйте промоущий буфер А для промывки стенок тела два раза по 2 минуты каждый, прежде чем добавить разведение полимеразы от 1 до 80 в раствор для амплификации. Выдерживать в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия.
Чтобы подготовить образцы к визуализации, используйте буфер для промывки B для промывки стенок тела дважды по 10 минут каждая. Затем используйте 100-кратное разбавление буфера для стирки B, чтобы сделать окончательную стирку в течение 1 минуты. Уравновесьте стенки кузова в нескольких каплях монтажного раствора не менее чем на 30 минут.
С помощью тонких щипцов аккуратно перенесите стенки тела на горку платформы кутикулой вниз. Расположите их рядами в одной и той же ориентации в одной-двух каплях от монтажного раствора. Наденьте на препарат покровную крышку размером 22 на 40 миллиметров, стараясь не образовывать пузырьки воздуха. Затем используйте прозрачный лак для ногтей, чтобы запечатать предметное стекло.