Определение способности изолированных митохондрий удерживать кальций

Поместите митохондрии, выделенные из клеток нейробластомы, в буфер, содержащий непроницаемый для мембран, связывающий кальций флуоресцентный краситель.

Инкубируйте, чтобы митохондрии стабилизировались в буфере.

Добавьте кальцийсодержащий буфер и инкубируйте с встряхиванием.

Ионы кальция связываются с молекулами красителя, вызывая их флуоресценцию.

Используя флуоресцентный спектрометр, контролируйте флуоресценцию красителя в режиме реального времени.

Теперь вводите кальцийсодержащий буфер через равные промежутки времени.

Повышенная концентрация кальция способствует усвоению кальция митохондриями, уменьшая количество свободных ионов кальция, доступных для связывания с красителем, что приводит к снижению флуоресценции.

Как только митохондрии достигают максимальной емкости хранения кальция, дальнейшее добавление кальция запускает открытие переходной поры митохондриальной проницаемости (mPTP).

Это отверстие пор высвобождает кальций из митохондрий в буфер, где он связывается с красителем и вызывает повышенную флуоресценцию.

Определите общее количество кальция, необходимое для индуцирования открытия mPTP, которое отражает способность митохондрий удерживать кальций.

Перед началом эксперимента приготовьте среду на основе хлорида калия и добавьте зеленый флуоресцентный краситель, связывающий кальций, до конечной концентрации 0,5 микромоля. Чтобы определить способность митохондрий удерживать кальций, сначала перенесите 1 миллилитр изолированных митохондрий в среде хлорида калия, содержащей 0,5 микромолярного кальций-связывающего зеленого флуоресцентного красителя, в каждую лунку 6-луночного планшета.

Инкубируйте митохондрии в кальций-связывающем зеленом флуоресцентном красителе в 6-луночном планшете при комнатной температуре. Защитите его от постороннего света в течение 1 минуты. После инкубации добавьте 4 микролитра аликвот 20-миллимолярного раствора хлорида кальция в каждую лунку 6-луночного планшета, используя автоматическую настройку дозирования, чтобы ввести 200 наномолей кальция на миллиграмм митохондриального белка.

Используйте флуоресцентный спектрометр для мониторинга изменений флуоресценции каждые три секунды в течение 2 минут с длиной волны возбуждения 506 нанометров и длиной волны излучения 531 нанометр. Пластина оснащена встряхиванием при 600 об/мин в течение 3 секунд между показаниями, управляемым программным обеспечением. Добавьте в каждую лунку дополнительно 4-микролитр аликвоты 20-миллимолярного раствора хлорида кальция, затем следите за изменениями флуоресценции каждые 3 секунды в течение 2 минут.