Определение способности изолированных митохондрий удерживать кальций

Поместите митохондрии, выделенные из клеток нейробластомы, в буфер, содержащий непроницаемый для мембран, связывающий кальций флуоресцентный краситель.

Инкубируйте, чтобы митохондрии стабилизировались в буфере.

Добавьте кальцийсодержащий буфер и инкубируйте с встряхиванием.

Ионы кальция связываются с молекулами красителя, вызывая их флуоресценцию.

Используя флуоресцентный спектрометр, контролируйте флуоресценцию красителя в режиме реального времени.

Теперь вводите кальцийсодержащий буфер через равные промежутки времени.

Повышенная концентрация кальция способствует усвоению кальция митохондриями, уменьшая количество свободных ионов кальция, доступных для связывания с красителем, что приводит к снижению флуоресценции.

Как только митохондрии достигают максимальной емкости хранения кальция, дальнейшее добавление кальция запускает открытие переходной поры митохондриальной проницаемости (mPTP).

Это отверстие пор высвобождает кальций из митохондрий в буфер, где он связывается с красителем и вызывает повышенную флуоресценцию.

Определите общее количество кальция, необходимое для индуцирования открытия mPTP, которое отражает способность митохондрий удерживать кальций.

Перед началом экспериме