Иммуногистохимия участков мозговой ткани мыши для нацеливания на дофаминовые нейроны

Возьмите слайд с полимерным покрытием со срезами ткани мозга мыши, содержащими дофаминовые нейроны, экспрессирующие тирозингидроксилазу, ключевой фермент для синтеза дофамина.
Обведите срезы гидрофобной ручкой, чтобы обеспечить равномерное окрашивание.
Зафиксируйте ткань в растворе ацетона-метанола для сохранения морфологии ткани.
Промойте буфером, содержащим моющее средство, чтобы проникнуть в клеточные мембраны.
Инкубируйте с первичными антителами, нацеленными на тирозингидроксилазу в дофаминовых нейронах, затем промойте для удаления несвязанных антител.
Добавьте флуоресцентные меченные красителем вторичные антитела, ядерный краситель и ингибиторы РНКазы.
Во время инкубации вторичные антитела связываются с первичными антителами, ядерные красители помечают ядро, а ингибиторы РНКазы инактивируют РНКазы.
Промойте буфером. Затем обезвоживайте участки тканей в возрастающих концентрациях этанола.
Инкубируйте в ксилоле, чтобы очистить ткань.
Обработанные участки ткани теперь готовы к микродиссекции лазерного захвата, которая позволяет точно визуализировать и препарировать целевые дофаминовые нейроны.

Чтобы провести иммуногистохимию, используйте гидрофобную ручку, чтобы обвести ткань и дать ей высохнуть. Затем в растворе метанола ацетона 1 к 1 зафиксируйте ткань при отрицательной температуре 20 градусов Цельсия на 10 минут. После извлечения салфетки из морозильной камеры накройте срезы от 100 до 200 микролитров антитела тирозингидроксилазы в PBS и 1% тритона на 10 минут.

Затем используйте PBS с 1% тритоном для промывки слайдов, прежде чем покрывать секции от 100 до 200 микролитров козьего антикроличьей IgG, помеченного Alexa Fluor 488. Выдерживайте в течение пяти минут, а затем дважды промывайте предметные стекла с помощью PBS. Затем обезвоживайте образцы в градуированной серии свободного этанола РНКазы в течение 30 секунд каждая, как было показано ранее в этом видео. Выдерживать в ксилоле в течение одной минуты и второй промывки в течение пяти минут. Снимите предметные стекла непосредственно перед использованием для LCM и дайте им высохнуть на воздухе.