Изучение переноса мембранных белков в клетках фоторецепторов дрозофилы

Возьмем адаптацию к темному, обезболивающую, трансгенную, белоглазую муху.

Муха экспрессирует ионные каналы TRPL, помеченные eGFP, в фоторецепторах глаза.

В темноте TRPL локализуется на мембранах рабдомеров — микроворсинках фоторецепторов.

Используя сжатый воздух, вдавите муху головой вперед в наконечник пипетки.

Обрежьте кончик и отодвиньте ширинку назад.

Снова обрежьте его и вытолкните муху вперед, пока не будет выступать только ее голова.

Обездвижите кончик пластилина, прикрепленного к предметному стеклу, и поместите его на предметный столик флуоресцентного микроскопа так, чтобы глаз был обращен к объективу микроскопа радиально.

Добавьте каплю воды на объектив, затем опустите его, пока он не коснется глаза.

Захват изображений фоторецепторов.

Измерьте интенсивность флуоресценции в рабдомерах, теле клетки и фоне.

Осветите муху оранжевым светом, чтобы вызвать транслокацию TRPL к телу клетки.

Повторите измерения изображений и флуоресценции.

Сравните изображения, чтобы наблюдать сниженную рабдомерную флуоресценцию после освещения, указывающую на транслокацию TRPL в тело клетки.

Чтобы приготовить муху в нелетальном варианте, перенесите обезболенную льдом муху головой вперед в наконечник пипетки объемом 200 микролитров и осторожно подтолкните муху к кончику сжатым воздухом. Затем с помощью скальпеля отрежьте кончик пипетки прямо перед головой. И с помощью пинцета аккуратно протолкните мушку на несколько миллиметров в кончик пипетки.

Снова отрежьте кончик пипетки. И с помощью сжатого воздуха оттолкните муху обратно к кончику так, чтобы из кончика пипетки выступала только головка мухи. Наклеив кусочек пластилина на предметное стекло, вдавите в него кончик пипетки так, чтобы левый или правый глаз был обращен вверх. Убедитесь, что глаз правильно ориентирован под микроскопом. Для получения изображения выберите объектив погружения в воду.

В случае нелетального варианта используйте лабораторную пипетку, чтобы приклеить большую каплю охлажденной воды к нижней стороне объекта для погружения в воду. Аккуратно поместите предметное стекло с подготовленной мухой на предметный столик микроскопа. Затем опустите объектив погружения в воду вручную до тех пор, пока он не коснется поверхности воды или глаз мухи не коснется капли.

Затем переключите световой путь на камеру микроскопа и сгенерируйте изображение в реальном времени. Отрегулируйте фокус для камеры и оцените ориентацию глаза, учитывая, что глаз должен быть направлен на объектив микроскопа радиально. Используйте программное обеспечение для таблиц поиска для обнаружения перенасыщения.

В случае непигментированных мух отрегулируйте время экспозиции таким образом, чтобы самые яркие пиксели были чуть ниже предела насыщенности для каждого изображения. Запишите изображение и сохраните его в виде необработанного файла, чтобы архивировать все соответствующие метаданные записи. Затем экспортируйте изображение в точечный формат TIFF.

Чтобы количественно оценить относительную флуоресценцию EGFP в рабдомерах водно-иммерсионных микрофотографий, отрегулируйте параметры ImageJ, нажав на кнопку «Анализ». Затем установите измерения и отметьте галочкой только среднее значение серого. Импортируйте изображение TIFF с точкой, нажав на кнопку «Файл», затем откройте его. Выберите репрезентативную область изображения в фокусе и увеличьте ее до 200–300%, многократно нажимая клавиши Control и Plus вместе.

Далее выберите инструмент Овал (Oval). И при нажатии клавиши Shift сгенерируйте круговое выделение на изображении, которое значительно меньше одного флуоресцентного рабдомера. Затем найдите точный размер, отображаемый под панелью инструментов в главном окне ImageJ. Чтобы измерить интенсивность флуоресценции в круговом выделении, переместите круг к первому рабдому с помощью клавиш со стрелками на клавиатуре и нажмите «Анализировать», затем измерьте.

Появится окно со списком измеренных значений серого. Продолжайте измерения рабдомеров со 2 по 6, а также измерьте фоновый сигнал. В случае непигментированных мух проведите дополнительные замеры соответствующих участков тела клеток. Измерьте флуоресценцию еще двух омматидий, в результате чего получите три технических повтора. Отметьте проанализированные омматидии с помощью инструмента «Карандаш» и сохраните это изображение для документации.

Выберите и скопируйте измеренные значения серого цвета в окне результатов и вставьте их в программное обеспечение для работы с электронными таблицами для дальнейших расчетов. Отсортируйте значения интенсивности флуоресценции в соответствии с их происхождением по рабдомере, телу клетки и фону категории, а также рассчитайте среднюю интенсивность для каждой категории. Затем рассчитайте относительное количество EGFP, присутствующего в рабдомере, используя первую формулу для непигментированных глаз, а вторую — для пигментированных глаз.