Обнаружение модификаций гистонов в дрожжевых клетках с гиперэкспрессией нейродегенеративных белков
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 5:16 мин • April 28th, 2025
Начните с суспензии дрожжевых клеток, сверхэкспрессирующих белки, связанные с нейродегенеративными заболеваниями.
Этот сверхэкспрессированный белок отвечает за модификации белков, упаковывающих ДНК, или гистонов с химическими фрагментами.
Добавьте гидроксид натрия и бета-меркаптоэтанол, а затем инкубируйте на льду.
Гидроксид натрия и бета-меркаптоэтанол лизируют клетки, высвобождая внутриклеточные белки, включая гистоны.
Центрифугируйте лизат для сбора белков. Выбросьте надосадочную жидкость.
Добавьте краситель для загрузки в белковые гранулы и нагрейте их, чтобы денатурировать их.
Загрузите эти денатурированные белки и белковый маркер на гель и электрофоризируйте, чтобы разделить их по размеру.
Электропереносите белки на мембрану, промойте и добавьте блокирующий буфер для предотвращения неспецифического связывания.
Добавьте первичные антитела, которые специфически связываются с модифицированными гистонами.
Промойте для удаления несвязанных антител и инкубируйте с флуоресцентными вторичными антителами, которые связываются с первичными антителами.
Отчетливая флуоресцентная полоса подтверждает модификации гистонов, указывая на сверхэкспрессию нейродегенеративных белков.
Чтобы лизировать клетки для вестерн-блоттинга, разморозьте гранулы дрожжевых клеток на льду перед ресуспензией в 100 микролитрах дистиллированной воды. Добавьте 300 микролитров 0,2 молярного гидроксида натрия и 20 микролитров 2-меркаптоэтанола в каждый образец клетки. И повторно суспендируйте гранулы с помощью пипетирования.
После 10-минутной инкубации на льду гранулируйте клетки центрифугированием и повторно суспендируйте образцы в 100 микролитрах загрузочного красителя. Затем прокипятите образцы в течение 10 минут на нагревательном блоке. Пока образцы лизируются, поместите два геля в держатель геля и заполните внутреннюю камеру доверху проточным буфером, а внешнюю камеру до отметки линии из двух гелей.
Когда образцы будут готовы, загрузите по 15 микролитров раствора для лизиса каждой клетки в каждую лунку 10-луночного 12% полиакриламидного геля и добавьте 5 микролитров белковой лестницы в лунку для белковой лестницы. Запустите гель в течение примерно 45 минут при напряжении 150 вольт или до тех пор, пока загруженный красный фронт не достигнет дна геля.
Пока гель работает, замочите две волоконные прокладки на гель в буфере для переноса и одну мембрану из поливинилиденфторида или PVDF на гель в метаноле. Когда гель будет готов, промойте мембрану и переведите буфер. И поместите одну предварительно замоченную волоконную прокладку на дно полусухой ячейки передаточного аппарата, за которой следует мембрана из PVDF, гель и вторая предварительно замоченная волоконная прокладка.
Затем установите мощность на 150 миллиампер на 1 час. По окончании переноса белка снимите мембрану с передаточного аппарата для кратковременного промывания дистиллированной водой. Поместите промытую мембрану белком вверх в небольшую коробку для окрашивания и накройте мембрану трис-буферным раствором или блокирующим буфером TBS на 1 час инкубации при комнатной температуре с легким покачиванием.
В конце блокирующей инкубации инкубируйте мембрану в течение ночи с антидрожжевым гистоном и модификационным специфическим антителом в TBS при 4 градусах Цельсия, а также соответствующим антителом для контроля ядерной нагрузки.
На следующее утро промыть мембрану четыре раза в TBS, с добавлением 0,1% полисорбата 20 в течение пяти минут с покачиванием при комнатной температуре за одну стирку. После последнего промывания инкубировать блот с соответствующими вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего следует четыре 5-минутных промывки в TBST и одно пятиминутное промывание в TBS только с укачиванием.
Затем визуализируйте блот на флуоресцентной системе визуализации вестерн-блоттинга в течение 2 минут.
Обзор
В данном исследовании представлен протокол анализа модификаций гистонов в клетках дрожжей, сверхэкспрессирующих белки, связанные с нейродегенеративными заболеваниями. Метод включает лизис клеток, разделение белков с помощью электрофореза и их детекцию с использованием специфических антител.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Анализ белков
Теоретическая часть
- Нейродегенеративные заболевания связаны с модификациями белков.
- Гистоны играют ключевую роль в упаковке ДНК и регуляции экспрессии генов.
- Изучение модификаций гистонов может дать представление о механизмах развития заболеваний.
- Модели на дрожжах полезны для изучения гиперэкспрессии белков.
Цель исследования
- Изучить влияние гиперэкспрессии нейродегенеративных белков на модификации гистонов.
- Разработать надежный метод детекции этих модификаций.
- Углубить понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе нейродегенеративных заболеваний.
Используемые методы
- Суспензия клеток дрожжей, гиперэкспрессирующих целевые белки.
- Лизис клеток с использованием гидроксида натрия и бета-меркаптоэтанола.
- Разделение белков методом SDS-PAGE и перенос на ПВДФ-мембраны.
- Детекция модифицированных гистонов с помощью специфических антител и флуоресцентного имиджинга.
Основные результаты
- Успешный лизис дрожжевых клеток и экстракция внутриклеточных белков.
- Четкое разделение белков на гелях SDS-PAGE.
- Обнаружение отчетливых флуоресцентных полос, указывающих на модификации гистонов.
- Подтверждение взаимосвязи между гиперэкспрессией белка и паттернами модификации гистонов.
Выводы
- Разработанный метод эффективно выявляет модификации гистонов в моделях дрожжей.
- Полученные результаты способствуют пониманию роли гистонов в нейродегенеративных заболеваниях.
- Данный подход может быть применен в дальнейших исследованиях модификаций белков.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественное определение модификаций гистонов в моделях дрожжей с гиперэкспрессией нейродегенеративных белков позволяет снизить механистические риски на пересечении эпигенетики и протеинопатии. Данный рабочий процесс поддерживает валидацию мишеней на ранних стадиях, связывая гиперэкспрессию белков с изменениями состояния хроматина, что повышает прогностическую достоверность путей, имеющих значение для нейродегенерации. Этот подход представляет собой многократно используемую платформу для изучения механизмов заболеваний и приоритизации мишеней в портфелях открытий, ориентированных на нейробиологию.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать причинно-следственную связь между гиперэкспрессией нейродегенеративных белков и паттернами модификации гистонов.
- Способствует снижению биологических рисков путем выяснения эпигенетических последствий протеинопатий, имеющих значение для заболевания.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе мишеней для исследований нейродегенерации.
Скрининг и разработка анализа
- Устанавливает валидированный рабочий процесс для обнаружения посттрансляционных модификаций гистонов в моделях дрожжей.
- Обеспечивает воспроизводимое детектирование с помощью антител, подходящее для количественного сравнения различных экспериментальных условий.
- Позволяет подготавливать стандартизированные лизаты и мембраны для последующего скрининга или оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты моделирования на дрожжах с эпигенетическими биомаркерами, имеющими значение для заболевания, для обеспечения трансляционной непрерывности.
- Позволяет осуществлять риск-ориентированное продвижение мишеней с подтвержденными механистическими связями с модификацией хроматина.
- Обеспечивает механистическое снижение рисков для доклинических программ по изучению нейродегенерации.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум открытий, начиная от ранних механистических исследований и заканчивая приоритезацией терапевтических мишеней на доклиническом этапе в исследованиях нейродегенерации.
- Биология открытий: Позволяет проверять гипотезы о влиянии гиперэкспрессии белков на состояние хроматина.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели модификаций гистонов для разработки методов анализа.
- Аналитика: Позволяет проводить статистическое сравнение уровней модификаций между экспериментальной и контрольной группами.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты, полученные на модели дрожжей, с эпигенетическими изменениями, имеющими значение при заболеваниях.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает стандартизированный протокол, адаптируемый для других исследований протеинопатий или хроматина.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность в валидации мишени путем установления связи между протеинопатией и эпигенетическими изменениями.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированное, масштабируемое и воспроизводимое выявление модификаций гистонов.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) мишеней нейродегенерации на основе механистических доказательств.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней с подтвержденным воздействием на хроматин с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области генетики дрожжей, биохимии белков и вестерн-блоттинга.
- Необходим доступ к оборудованию для электрофореза, переноса на мембрану и флуоресцентной визуализации.
- Требуется стандартизация антител и протоколов визуализации между исследовательскими группами.
- Метод может быть адаптирован для других модельных систем при оптимизации протоколов лизиса клеток и детекции.
- Достоверность результатов зависит от специфичности антител и количественного анализа изображений.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Очистка H3 и H4 Гистоны и количественная оценка ацетилированный гистона знаков в клетках и тканях мозга
Похожие видео
0 Просмотры
Анализы для проверки ингибиторов ацетилтрансферазы гистона
Похожие видео
0 Просмотры
Скрининг модификации гистонов с использованием жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и времяпролетной масс-спектрометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Рост анализы для оценки токсичности полиглутаминовых у дрожжей
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляция потенцированной Hsp104 вариантов Используя дрожжи Proteinopathy Модели
Похожие видео
0 Просмотры
Белок Очистка Техника, что позволяет выявлять и SUMOylation Убиквитинирование бутонизации дрожжей кинетохор белков Ndc10 и Ndc80
Похожие видео
0 Просмотры
целевое В Ситу мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах
Похожие видео
0 Просмотры
Высокопроизводительного скрининга для наследования на основе белков в S. cerevisiae
Похожие видео
0 Просмотры
Иммунопреципитации Chromatin (чип) изменения гистона от Saccharomyces cerevisiae
Похожие видео
0 Просмотры
Оценка влияния агрегации белков на сотовой окислительный стресс в дрожжи
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 22 августа 2026