Обнаружение белка α-синуклеина, ассоциированного с нейродегенеративными заболеваниями, с помощью ИФА

Начнем с мозговой ткани трансгенной мыши с гиперэкспрессией мутировавшего α-синуклеина, неправильно свернутого нейронного белка, связанного с нейродегенеративным заболеванием, погруженного в буфер с высоким содержанием соли.

Гомогенизируйте ткань с помощью большого пестика, а затем маленького пестика, чтобы разрушить ткань и высвободить внутриклеточные белки, в том числе α-синуклеин.

Переложите гомогенат в пробирку и центрифугу. Соберите белковосодержащую надосадочную жидкость и разведите ее буфером.

Добавьте эту надосадочную жидкость в микропланшет, покрытый α-синуклеин-специфическими антителами, предварительно обработанный блокатором для предотвращения неспецифического связывания.

Инкубируйте с перемешиванием, позволяя нормальному и мутировавшему α-синуклеину связываться.

Вымойте планшет, затем добавьте антитела для обнаружения, специфичные к мутировавшему α-синуклеину, и инкубируйте с перемешиванием.

Снова промойте и добавьте антитела, сцепленные с ферментами, с последующей инкубацией при перемешивании.

Добавьте субстрат и выдерживайте в темноте под перемешиванием. Субстрат вступает в реакцию с ферментом, вызывая изменение цвета.

Остановите реакцию с кислотой и измерьте абсорбцию для ко