Обнаружение белка α-синуклеина, ассоциированного с нейродегенеративными заболеваниями, с помощью ИФА
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 4:37 мин • April 28th, 2025
Начнем с мозговой ткани трансгенной мыши с гиперэкспрессией мутировавшего α-синуклеина, неправильно свернутого нейронного белка, связанного с нейродегенеративным заболеванием, погруженного в буфер с высоким содержанием соли.
Гомогенизируйте ткань с помощью большого пестика, а затем маленького пестика, чтобы разрушить ткань и высвободить внутриклеточные белки, в том числе α-синуклеин.
Переложите гомогенат в пробирку и центрифугу. Соберите белковосодержащую надосадочную жидкость и разведите ее буфером.
Добавьте эту надосадочную жидкость в микропланшет, покрытый α-синуклеин-специфическими антителами, предварительно обработанный блокатором для предотвращения неспецифического связывания.
Инкубируйте с перемешиванием, позволяя нормальному и мутировавшему α-синуклеину связываться.
Вымойте планшет, затем добавьте антитела для обнаружения, специфичные к мутировавшему α-синуклеину, и инкубируйте с перемешиванием.
Снова промойте и добавьте антитела, сцепленные с ферментами, с последующей инкубацией при перемешивании.
Добавьте субстрат и выдерживайте в темноте под перемешиванием. Субстрат вступает в реакцию с ферментом, вызывая изменение цвета.
Остановите реакцию с кислотой и измерьте абсорбцию для количественного определения мутировавшего α-синуклеина.
Чтобы получить гомогенаты мозга, добавьте достаточный объем буфера HS в рассеченные области мозга, чтобы достичь ожидаемого процента гомогената, как показано в таблице ниже. С помощью измельчителя для тканей, состоящего из трубки из боросиликатного стекла и двух пестиков, А и В, налейте в трубку область мозга, которую нужно измельчить. А затем с помощью пестика А гомогенизируйте ткань 10 раз, чтобы диссоциировать ее.
Затем переключитесь на пестик B и гомогенизируйте еще 20 раз. С помощью переводной пипетки перенесите гомогенат в пробирку объемом 1,5 миллилитра, повторив гомогенизацию с оставшимися образцами мозга. Центрифугируйте образцы при 1000 г в течение пяти минут, при четырех градусах Цельсия. А затем соберите надосадочную жидкость и разделите ее на аликвоты по 200 микролитров.
С помощью 100 микролитров раствора для покрытия антител покройте лунки 96 луночных микропланшетов и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день добавьте в лунки 300 микролитров PBST и с помощью машины для мытья тарелок вымойте пластины пять раз. Работая при комнатной температуре, в дальнейшем добавьте 200 микролитров блокирующего буфера T20 PBS в каждую лунку и встряхивайте пластины при 150 об/мин в течение одного часа, прежде чем использовать PBST для пятикратной промывки пластин.
Используя PBST, 1% BSA, разбавьте гомогенаты мозга, следуя указаниям, перечисленным здесь. И в каждую лунку добавляем по 100 микролитров. Затем инкубируйте при комнатной температуре и 150 об/мин в течение двух часов, прежде чем использовать PBST для пятикратной промывки пластин.
После окончательной промывки добавьте необходимые антитела для обнаружения альфа-синуклеина, разведенные в PBST и 1% BSA, как указано в таблице 2 текстового протокола. Инкубируйте при комнатной температуре и 150 об/мин в течение одного часа, прежде чем промыть пластины пять раз, как и раньше.
Затем добавьте конъюгаты против мышей или против кроликов IGG HRP, разведенные до 1-8000 в PBST, 1% BSA. И инкубировать при 150 оборотах в минуту в течение одного часа, прежде чем мыть пластины пять раз. Затем добавьте в каждую лунку по 100 микролитров раствора ТМБ, и выдерживайте при 150 оборотах в минуту в течение 15 минут в темноте. Остановите реакцию, добавив 100 микролитров одной обычной соляной кислоты на лунку. Затем с помощью считывателя микропланшетов измерьте поглощение на 450 нанометрах.
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол выявления ассоциированного с заболеванием α-синуклеина в тканях мозга трансгенных мышей с гиперэкспрессией мутировавшего человеческого α-синуклеина A53T с использованием усовершенствованного метода ELISA. Данная процедура позволяет проводить чувствительный количественный анализ как нормальных, так и мутировавших форм α-синуклеина, что имеет важное значение для исследований нейродегенеративных заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Исследование нейродегенеративных заболеваний
- Биохимия белков
Теоретические основы
- α-synuclein представляет собой нейрональный белок, участвующий в развитии нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона.
- Мутации в α-synuclein, такие как A53T, связаны с патологией заболевания.
- Количественное определение α-synuclein, ассоциированного с заболеванием, в тканях мозга имеет важное значение для понимания механизмов и прогрессирования болезни.
- Метод ELISA обеспечивает чувствительный и специфичный способ детекции белков в биологических образцах.
Цель исследования
- Разработка надежного протокола для обнаружения и количественного определения мутировавшего α-синуклеина в тканях головного мозга мыши.
- Обеспечение возможности дифференциации нормальных и ассоциированных с патологией форм α-синуклеина.
- Предоставление воспроизводимого метода для использования в моделях нейродегенеративных заболеваний.
Используемые методы
- Диссекция и гомогенизация тканей головного мозга трансгенных мышей в буфере с высоким содержанием соли с использованием стеклянных пестиков.
- Центрифугирование для отделения белкового супернатанта и подготовка аликвот.
- Покрытие 96-луночных микропланшетов антителами, специфичными к α-synuclein, и блокировка для предотвращения неспецифического связывания.
- Инкубация разведенных гомогенатов мозга в покрытых лунках с последующей последовательной инкубацией с детектирующими антителами и вторичными антителами, конъюгированными с ферментом.
- Колориметрическое детектирование с использованием субстрата TMB и измерение абсорбции при 450 nm для количественного определения уровней α-synuclein.
Основные результаты
- Данный протокол обеспечивает чувствительное детектирование как нормального, так и мутировавшего α-synuclein в гомогенатах мозга мышей.
- Усовершенствованный метод ELISA позволяет количественно определить формы α-synuclein, связанные с заболеванием.
- Специфичность метода подтверждается использованием антител, специфичных к конкретным мутациям.
- Результаты могут быть использованы для сравнения уровней α-synuclein в различных экспериментальных группах или моделях заболеваний.
Выводы
- Данный усовершенствованный протокол ИФА обеспечивает надежный и чувствительный подход к обнаружению ассоциированного с заболеванием α-synuclein в тканях головного мозга.
- Метод подходит для исследований, изучающих роль α-synuclein в нейродегенеративных заболеваниях.
- Он облегчает количественный анализ патологии белков в трансгенных моделях мышей.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественное определение α-синуклеина, связанного с заболеванием, с помощью метода ELISA обеспечивает надежную валидацию мишени и снижение механистических рисков в исследованиях нейродегенеративных заболеваний. Данный рабочий процесс повышает прогностическую уверенность на ранних этапах открытия и в точках перехода к доклиническим исследованиям, что позволяет обосновать решения по портфелю терапевтических программ, направленных на лечение протеинопатий. Надежное измерение уровней мутировавшего α-синуклеина в трансгенных моделях обеспечивает трансляционную непрерывность от этапа открытия до доклинической валидации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать α-синуклеин как релевантную мишень заболевания в моделях нейродегенерации.
- Способствует снижению биологических рисков путем дифференциации нормальных и мутантных форм белка.
- Предоставляет количественные данные для обеспечения прогностической достоверности в исследованиях взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных и воспроизводимых результатов ELISA для последующего скрининга соединений.
- Способствует стандартизации и масштабируемости анализа в различных экспериментальных когортах.
- Позволяет проводить достоверное сравнение уровней α-synuclein между экспериментальными группами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует количественному определению биомаркеров, имеющих значение для заболевания, в трансгенных моделях мышей.
- Обеспечивает непрерывность процесса от раннего поиска до доклинической валидации терапевтических гипотез.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе количественного анализа патологии белков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод детекции на основе ИФА интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований в рамках программ по изучению нейродегенеративных заболеваний.
- Биология открытий: обеспечивает количественную проверку гипотез о роли α-synuclein в моделях заболеваний.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные результаты анализа для оценки соединений.
- Аналитика: позволяет измерять уровни белка на основе абсорбции для статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: связывают результаты открытий с доклинической валидацией биомаркеров в соответствующих моделях.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированную, адаптируемую платформу для количественного определения белков в рамках исследовательских цепочек по нейродегенеративным заболеваниям.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишени.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов по детекции белков.
- Стратегическая ценность: оптимизирует процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала за счет предоставления надежных количественных данных.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению активов в области терапии нейродегенеративных заболеваний.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области биохимии белков и разработки методов ИФА.
- Необходим доступ к микропланшетным ридерам, валидированным антителам и стандартизированным реагентам.
- Требуется строгая стандартизация протоколов гомогенизации и проведения анализа между всеми исследовательскими группами.
- Метод может быть адаптирован к различным трансгенным или соответствующим конкретным заболеваниям модельным системам при условии подбора подходящих антител.
- Воспроизводимость результатов зависит от точности подготовки образцов и контроля условий инкубации.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Последовательное извлечение растворимых и нерастворимых Альфа-синуклеина из Паркинсона Brains
Похожие видео
0 Просмотры
Биолюминесценция Визуализация нейровоспаления у трансгенных мышей после инокуляции периферической альфа-синуклеина фибрилл
Похожие видео
0 Просмотры
Поколение альфа-нуклеин предварительно сформированные фибриллы из мономеров и использовать в естественных условиях
Похожие видео
0 Просмотры
Определение фосфорилированного альфа-синуклеина с помощью вестерн-блоттинга
Похожие видео
0 Просмотры
Иммунофлуоресцентный анализ для выявления агрегатов альфа-синуклеина в биопсийном срезе кожи
Похожие видео
0 Просмотры
Иммуноокрашивание нейронов, обработанных агрегатами альфа-синуклеина
Похожие видео
0 Просмотры
Выявление заболевания, связанного α-синуклеина-повышенной ELISA в мозге трансгенных мышей с гиперэкспрессией Human A53T Мутация α-синуклеина
Похожие видео
0 Просмотры
Высокая пропускная способность, Multiplexed и Targeted Протеомный CSF Анализ на Количественно нейродегенеративных биомаркеров и аполипопротеина Е изоформы Статус
Похожие видео
0 Просмотры
Администрации экзогенных микросом связанные альфа synuclein агрегатов для первичной нейроны как мощный ячеечная модель формирования фибрилл
Похожие видео
0 Просмотры
Ориентация Альфа Синуклеин Агрегаты в кожных периферных нервных волокон по свободно плавающей иммунофлуоресценции Анализ
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026