ЖХ-МС/МС Анализ протеомного профиля гранул нейромеланина, выделенных из ткани головного мозга человека

Начните с пептидов, полученных из гранул нейромеланина (NMG), выделенных из посмертной ткани человеческого мозга.

NMGs, обнаруженные в нейронах, производящих допамин, содержат пигмент нейромеланин, белки и липиды.

Возьмем колонку высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), содержащую стационарную фазу на основе диоксида кремния, функционализированную гидрофобными лигандами.

Загрузите пептиды в столбец.

Гидрофобные пептиды связываются с колонкой сильнее, чем гидрофильные.

Пропустите буфер элюирования через столбец.

Менее гидрофобные пептиды сначала вымываются, в то время как более гидрофобные вымываются позже.

Элюированные пептиды поступают в источник ионизации электроспрея масс-спектрометра, где они ионизируются в заряженные пептидные ионы.

Ионизированные пептиды затем поступают в масс-анализатор, где они разделяются на основе их отношения массы к заряду.

Выбранный пептидный ион направляется в ячейку столкновения и фрагментируется на более мелкие ионы, отношение массы к заряду которых измеряется снова.

Наконец, данные сравниваются со справочной базой данных для идентификации белков, присутствующих в образце NMG.

После выполнения триптического разложения, как описано в тексте, подготовьте образец для анализа ВЭЖХ-МС, растворив от 200 до 400 нанограммов пептидов образца в определенном объеме 0,1% TFA в отверстиях флаконов из инертного масс-спектрометрического стекла. Если определение концентрации неприменимо из-за малого количества образца, проверьте идентичную нагрузку образца, сравнив общий ток ионов.

Чтобы начать протеомный анализ необработанных данных, нажмите Загрузить для загрузки необработанных файлов в программное обеспечение. Нажмите «Установить эксперимент», чтобы назначить имена образцов. Чтобы определить параметры, специфичные для группы, добавьте изменения, выбрав Deamidation NQ, Oxidation M и Carbaminomethylation N-Term в качестве переменных модификаций. А затем добавить карбаминометилирование С в качестве фиксированной модификации. Выберите трипсин в качестве фермента пищеварения в вкладке пищеварения.

На вкладке Quantification без меток. Добавьте опцию, LFQ. А если необходимо обработать более 10 файлов, выберите опцию быстрого LFQ, чтобы сократить время обработки. Убедившись, что все остальные параметры, специфичные для группы, остаются в заводских настройках, перейдите на вкладку «Глобальные параметры» и добавьте файл FASTA, производный от uniprot.org на вкладке «Последовательности». Измените правило идентификатора соответствующим образом и добавьте идентификатор таксономии 9606 для Homo sapiens.

Для количественного определения белка выбирайте уникальные и бритвенные пептиды. Затем добавьте параметр iBAQ в качестве меры для количественного определения белка на вкладке «Количественная оценка» без меток. Убедитесь, что все остальные глобальные параметры остались в заводских настройках, и нажмите «Пуск». После успешного выполнения анализа извлеките .txt выход белковой группы.