Иммуноцитохимическая визуализация для визуализации миграции клеток глиомы у детей

Начните с многолуночной пластины с плоским дном, покрытой матрицей базальной мембраны, которая содержит внеклеточный полимер и белки адгезии, имитирующие матрицу микроокружения опухоли.

Введите среду, содержащую нейросферу клеток глиомы, полученных из опухоли мозга у ребенка, обеспечивая ее центральное расположение в колодце.

Матрица способствует прикреплению нейросферы к колодцу.

Добавьте реагент для подавления фона для минимизации неспецифической флуоресценции.

Далее вводим зеленые антитела против CD44, конъюгированные с флуорофорами.

Перенесите пластину в систему визуализации живых клеток, размещенную в инкубаторе, которая поддерживает физиологические условия клетки.

Со временем клетки глиомы экспрессируют белок клеточной адгезии CD44, который взаимодействует с белками адгезии.

Это активирует клеточный сигнальный путь и облегчает миграцию клеток из нейросферы.

Флуорофор-конъюгированные анти-CD44 антитела связываются с экспрессированным CD44 на клетках глиомы, заставляя их флуоресцировать.

Появление зеленых флуоресцентных клеток, удаляющихся от нейросферы, подтверждает миграцию клеток глиомы.

Как только колодцы будут покрыты BMM, вырежьте наконечник P200. Возьмите по 50 микролитров клеточной среды и NS из каждой выбранной лунки и переложите ее в плоскую лунку с покрытием. Проверьте наличие и положение NS в каждой лунке визуально. Аккуратно добавьте по 50 микролитров разведенных антител BSR и ALR в каждую лунку, подождая две-три минуты, чтобы реагенты смешались. А с помощью инвертированного микроскопа убедитесь, что большая часть репликатных NS расположена в центре скважины. Убедившись в отсутствии пузырьков, аккуратно перенесите планшет в прибор для анализа живых клеток, как показано ранее.

В программном обеспечении для анализа живых клеток выберите опцию Schedule To Acquisition. Затем нажмите на вкладку с плюсом и выберите «Сканировать по расписанию», чтобы отсканировать пластины с интервалами, как указано в текстовой рукописи. В окне программного обеспечения создайте или восстановите судно, а затем нажмите на опцию «Создать». Выберите тип сканирования «Клонирование разведения», объектив 4X, а также фазу и зеленый для анализа миграции. Выберите тип пластины и определите скважины для сканирования, выделив их на карте пластин. Затем настройте частоту сканирования. Нажмите «Добавить в расписание» и начните сканирование.