Характеристика сфероидов нейроэндокринных опухолей тонкой кишки с помощью иммунофлюоресценции

Возьмите сфероиды нейроэндокринных опухолей тонкой кишки в пробирке.

Добавьте фиксативный раствор для сохранения клеток.

Чтобы промыть, центрифугировать и заменить фиксатор на буфер.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, чтобы удалить остатки фиксатора.

Добавьте буфер, содержащий моющее средство и блокирующий агент, чтобы проникнуть в клеточные мембраны и предотвратить связывание неспецифических антител.

Постирайте с буфером, чтобы удалить излишки моющего средства и блокирующего средства.

Инкубируйте с первичными антителами, которые связываются с белком-мишенью, специфичным для нейроэндокринной клетки.

Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела.

Добавьте помеченные флуорофором вторичные антитела, которые связываются с первичными антителами.

Промойте буфером для удаления избытка антител.

Добавьте монтажную среду, содержащую краситель для окрашивания ядра.

Перенесите сфероиды на слайд и закрепите с помощью защитного стекла.

Используйте флуоресцентный микроскоп для визуализации нейроэндокринных клеток сфероида, экспрессирующих специфические белки.

Исправьте органоиды, добавив 500 микролитров параформальдегида и инкубируя их в течение 15 минут. После инкубации дважды промойте культуру 1 миллилитром PBS. Добавьте 500 микролитров PBS с 3% BSA и 0,1% Triton X-100 для проникновения культуры. Инкубируйте пробирку в течение пяти минут, затем трижды промойте органоиды 1 миллилитром PBS и 3% BSA.

Затем инкубируйте культуру с первичными антителами в течение одного часа, затем повторите промывки с PBS и BSA. Инкубируйте со вторичными антителами и повторите промывки, убедившись, что все надосадочная жидкость аспирирована и отброшена.

Чтобы получить изображение сфероидов, добавьте 5 микролитров монтажной среды, содержащей DAPI, и используйте пипетку P20, чтобы перенести 5 микролитров сфероидов на предметное стекло. Запечатайте предметное стекло защитным накладкой и сделайте изображение с помощью флуоресцентного микроскопа с объективами 10, 20 и 40 раз.