JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:28 мин • April 28th, 2025
Возьмем многолуночную пластину, содержащую микроглиеподобные клетки, проявляющие фагоцитарную активность.
Инкубируйте с ядерным красителем, чтобы пометить ядра.
Добавьте ингибитор полимеризации актина в лунку отрицательного контроля.
Во время инкубации ингибитор связывается с актиновыми филаментами, ингибируя полимеризацию актина и фагоцитоз.
Поддерживайте пластину при низких температурах и добавляйте pH-чувствительные к красителю человеческие синаптосомы - изолированные фрагменты нейронных синаптических окончаний.
Центрифугируйте планшет при низких температурах, чтобы стимулировать взаимодействие между клеткой и синаптосомой, но предотвратить преждевременное поглощение.
Перенесите пластину в систему визуализации живых клеток.
В тестовом колодце синаптосомы фагоцитируются и сливаются с лизосомами, образуя фаголизосомы. Лизосомальная кислая среда активирует краситель, в результате чего происходит его флуоресценция.
Со временем, в тестовом колодце, поглощается больше синаптосом, что приводит к дальнейшему увеличению флуоресценции.
Однако в отрицательном контрольном колодце полимеризация актина подавляется, препятствуя поглощению синаптосом. Полученная минимальная флуоресценция подтверждает зависимость флуоресценции от актин-опосредованного фагоцитоза.
В день анализа удалите 40 микролитров среды на лунку и добавьте 10 микролитров раствора ядерного окрашивания. Выдержите тарелку в течение двух часов. Разморозьте помеченные синаптосомы на льду и аккуратно обрабатывайте ультразвуком с помощью водного ультразвука в течение одной минуты. Опять же, сразу же поместите синаптосомы на лед. Разбавьте меченые синаптосомы и полную среду IMG из расчета 1 микролитр синаптосом на 50 микролитров среды.
Для отрицательного контроля приготовьте 60 микромолярного цитохалазина D в полной среде IMG, чтобы ингибировать полимеризацию актина и, таким образом, фагоцитоз. Затем добавьте по 10 микролитров этого раствора в каждую лунку для окончательной концентрации 10 микромоляров и выдерживайте в течение 30 минут. Достаньте тарелку из инкубатора и инкубируйте при температуре 10 градусов Цельсия в течение 10 минут. Держите тарелку на льду и добавьте 50 микролитров среды, содержащей синаптосомы.
Центрифугируйте пластину при температуре 270 раз g в течение трех минут при температуре 10 градусов Цельсия и держите пластину на льду до получения изображения. Вставьте планшет в считыватель изображений живых клеток и выберите лунки для анализа. Затем выберите объектив с 20-кратным увеличением. Затем отрегулируйте интенсивность светодиода фокусировки или светодиода, время интеграции и усиление яркого поля и синих каналов. Флуоресценция синаптосомы должна быть пренебрежимо малой в начальный момент времени.
Выберите количество отдельных плиток, которые будут получены в монтаже для каждой лунки. Получите 16 плиток в центре скважины, визуализируя примерно 5% от общей площади скважины. Установите температуру на 37 градусов Цельсия и желаемый временной интервал для визуализации.
В данном исследовании изучается фагоцитарная активность микроглиеподобных клеток с помощью системы визуализации живых клеток. Анализируется влияние ингибирования полимеризации актина на захват синаптосом для понимания механизмов фагоцитоза.
Количественные анализы фагоцитоза живых клеток с использованием человеческих синаптосом и микроглиеподобных клеток представляют собой надежную платформу для изучения нейроиммунных механизмов, имеющих значение для разработки препаратов при нейродегенеративных заболеваниях. Данный подход позволяет снизить механистические риски и подтвердить валидность мишеней путем изоляции актин-зависимой фагоцитарной функции в системе, релевантной для человека. Этот анализ обеспечивает прогностическую уверенность при принятии решений на ранних этапах формирования портфеля исследований в области нейровоспаления и поддержания синаптических связей.
Данный анализ живых клеток применяется на этапе от раннего поиска до идентификации соединений-лидеров, предоставляя практически значимые данные для валидации мишеней и изучения механизмов в нейробиологии.
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026