Обнаружение фосфорилированного нейронального калий-хлоридного котранспортера 2 с помощью вестерн-блоттинга

Возьмем клеточный лизат, содержащий хлоридный калий-котранспортер 2, или белки KCC2, которые регулируют уровень хлорида нейронов.

Фосфорилирование в регуляторных центрах нарушает функцию KCC2, модулируя активность нейронов.

Добавьте лизат в гранулы, конъюгированные с антителами, нацеленными на фосфорилированный KCC2. Инкубируйте, чтобы обеспечить связывание, затем промойте, чтобы удалить несвязанные белки и клеточный мусор.

Обработайте денатурирующим буфером при высокой температуре, чтобы высвободить KCC2, затем центрифугируйте для разделения шариков.

Загрузите содержащую KCC2 надосадочную жидкость в гель для электрофореза. Разделите белки на полосы, чтобы подтвердить наличие фосфорилированного KCC2.

Перенесите полосы на мембрану, затем инкубируйте в блокирующем растворе, чтобы замаскировать неспецифические участки связывания.

Инкубируйте с первичными антителами, нацеленными на фосфорилированный KCC2.

Промойте, затем инкубируйте с помеченными ферментами вторичными антителами, чтобы пометить первичные антитела.

Промойте еще раз, затем добавьте хемилюминесцентную подложку, которая вступает в реакцию с ферментом, образуя свет.

Измерьте интенсивность света, чтобы количественно определить фосфо