Обнаружение фосфорилированного нейронального калий-хлоридного котранспортера 2 с помощью вестерн-блоттинга

Возьмем клеточный лизат, содержащий хлоридный калий-котранспортер 2, или белки KCC2, которые регулируют уровень хлорида нейронов.

Фосфорилирование в регуляторных центрах нарушает функцию KCC2, модулируя активность нейронов.

Добавьте лизат в гранулы, конъюгированные с антителами, нацеленными на фосфорилированный KCC2. Инкубируйте, чтобы обеспечить связывание, затем промойте, чтобы удалить несвязанные белки и клеточный мусор.

Обработайте денатурирующим буфером при высокой температуре, чтобы высвободить KCC2, затем центрифугируйте для разделения шариков.

Загрузите содержащую KCC2 надосадочную жидкость в гель для электрофореза. Разделите белки на полосы, чтобы подтвердить наличие фосфорилированного KCC2.

Перенесите полосы на мембрану, затем инкубируйте в блокирующем растворе, чтобы замаскировать неспецифические участки связывания.

Инкубируйте с первичными антителами, нацеленными на фосфорилированный KCC2.

Промойте, затем инкубируйте с помеченными ферментами вторичными антителами, чтобы пометить первичные антитела.

Промойте еще раз, затем добавьте хемилюминесцентную подложку, которая вступает в реакцию с ферментом, образуя свет.

Измерьте интенсивность света, чтобы количественно определить фосфорилированный KCC2 в лизате.

Пипетка 300 микролитров белка G сефарозы в микроцентрифужную пробирку. Затем центрифугируйте раствор при 500 G в течение двух минут. Выбросив надосадочную жидкость, добавьте 500 микролитров PBS и хорошо вортекс. Выбросьте надосадочную жидкость после центрифугирования и повторите этот шаг.

Затем смешайте 1 миллиграмм антител против KCC2 треонина 906 и анти-KCC2 треонина 1007 с 200 микролитрами гранул сефарозы белка G, прежде чем составить объем до 500 микролитров с PBS. После встряхивания на вибрационной платформе, или вращающегося колесе в течение двух часов при температуре 4 градуса Цельсия, повторите две промывки с PBS.

Проведите количественное определение белка на клеточных лизатах, добавьте 1 миллиграмм клеточного лизата к промытым шарикам и инкубируйте в сквозном ротаторе перед вращением. Проведите три промывки PBS, содержащим 150 миллимоляров хлорида натрия, а затем три промывки 200 микролитрами PBS перед тем, как повторно суспендировать окончательную гранулу в 100 микролитрах буфера для проб LDS.

Встряхните трубки в роторном шейкере при комнатной температуре в течение пяти минут. Инкубируйте их в нагревательном блоке, и центрифугируйте перед использованием надосадочной жидкости для загрузки геля. Соберите аппарат для литья вестерн-блотс и налейте свежеприготовленный 8% разделительный гель для литья геля, оставляя около 2 сантиметров пространства от верхней части литейного стекла. Добавьте в установку 200 микролитров абсолютного изопропанола и дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 60 минут.

Удалите изопропанол с помощью пипетки и тщательно промойте гель примерно 200 микролитрами дистиллированной воды. После добавления свежеприготовленного 6% геля для укладки в отливочную установку, аккуратно уложите в лунку расческу и дайте постоять при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем закрепите отлитый гель в емкости для электрофореза.

После заливки работающего буфера в бак, загрузите 5 микролитров маркера молекулярной массы в первую лунку и равное количество белка в каждую лунку геля SDS-PAGE. Заполните пустые лунки LDS и запускайте гель в течение 90-120 минут при напряжении 120 вольт. Регидратируйте нитроцеллюлозную мембрану с помощью буфера, содержащего 20% метанола.

Промойте гель и мембрану с помощью буфера для переноса и аккуратно распределите их по стеку для подготовки. Расположите переносимый бутерброд в следующем порядке: отрицательный электрод, бутербродная пена, фильтровальная бумага, промытый гель SDS-PAGE, промытая нитроцеллюлозная мембрана, фильтровальная бумага, сэндвич-пена, положительный электрод. После этого сложите собранный бутерброд в передаточный бак и работайте при напряжении 90 вольт в течение 90 минут или при напряжении 30 вольт в течение 360 минут.

Заблокируйте сухую мембрану на 1 час при комнатной температуре, используя блокирующий буфер. Инкубируйте мембраны с соответствующими разведениями первичного антитела и бета-актина в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 градусах Цельсия. Затем дайте три полоски TBST по 5 минут каждое.

Инкубируйте промытую мембрану с вторичным антителом, разведенным в блокирующем буфере в течение 60 минут, и повторите три промывки TBST. После этого поместите промытую мембрану на плату визуализации. Для выработки сигналов распределите раствор, приготовленный путем смешивания равных объемов каждого усиленного хемилюминесцентного реагента на мембране, перед передачей платы изображения в систему визуализации для визуализации.